02AUG

ACTIVITÉ RÉFÉRENTE EN VIROLOGIE

ÉTUDE GOULD (2016-2021, FRANCE)

Titre : L'ADN non intégré linéaire du VIH : rôle dans la latence virale

Objectif

Lors de l’infection par le VIH-1, la transcription inverse produit une molécule unique d’ADN linéaire assurant l’import nucléaire et l’intégration. La stabilité et la demi-vie de cet ADN viral non intégré linéaire (ULD pour Unintegrated Linear DNA) restent mal connues. Dans ce projet, nous souhaitons développer des outils capables de mesurer de façon spécifique et aussi sensible que possible la quantité d’ULD dans les cellules infectées, à la fois in vitro et in vivo. Nous quantifierons la cinétique de décroissance des ULD chez des patients initiant un traitement antirétroviral par combinaison d’inhibiteurs de la transcriptase inverse ou d’inhibiteur d’intégrase.

Résumé de l’état d’avancement au 31/12/2019 et perspectives

   La première phase du projet a consisté en la mise au point de la technologie nécessaire à la détection et la quantification des ULD. Cette technologie, appelée DUSQ (pour DNA Ultra Sensitive Quantification) montre un seuil de détection de 102 copies/106 cellules. Nous avons pu détecter et quantifier les ULD, 1) dans un modèle d’infection in vitro par le VIH-1 sur une lignée lymphoïde et observer une importante et rapide accumulation d’ULD stable dans le temps ; 2) dans des cellules de patients infectés par le VIH-1 et non traités.
   La stabilité réelle de ces ULD sera par la suite évaluée, puis nous estimerons la capacité de l'ULD à s'intégrer et à produire du virus.
   Nous nous concentrerons ensuite sur la nature des cellules dans lesquelles les ULD sont les plus susceptibles d'être synthétisés et stables.
   Nous étudierons ce phénomène dans différents types de cellules primaires et dans différentes conditions de stimulation. En intégrant l’équipe du Dr Anne Hosmalin à l’Institut Cochin, nous pourrons bénéficier de son expertise.
   La démonstration de l’efficacité de notre technologie de détection n’a malheureusement pas suffit à convaincre notre financeur principal, Viiv Healthcare, à continuer de financer cette étude et nous sommes actuellement à la recherche d’autres sources de financement pour pouvoir entamer l’étude clinique de la dynamique des ULD in vivo.

ÉTUDE ANCILLAIRE BIOMARQUEURS REFLATE TB (2017-2019, FRANCE)

Titre : Impact of raltegravir-based regimen on cellular viral reservoir and on kinetic inflammatory and coagulation biomarkers in HIV-1 infected-naïve patients – Substudy of the REFLATE TB ANRS 12-180)

Objectifs

• Partie I : Réservoir viral
     1) comparer l’effet du raltégravir (dose 400X2 et 800x2) sur le niveau d‘ADN VIH-1 cellulaire
     2) évaluer le niveau d’antigènémie P24 ultrasensible comme un nouveau bio marqueur de réservoir VIH.
• Partie II : Bio marqueurs d’inflammation (IL6, CD14s, CRPus et D-Dimères)
     1) décrire à l’inclusion le niveau des bio marqueurs chez des patients naïfs d’antirétroviraux et co-infectés par TB
     2) comparer l’effet des 2 traitements (5EFV vs RAL) sur la dynamique des bio marqueurs au cours du temps

État d'avancement

   Au 31/12/2019 : étude terminée.

ÉTUDE IMPACT SUR LE MICROBIOTE (2018-2020, FRANCE)

Titre : Étude du microbiote digestif chez des receveurs de cellules souches hématopoïétiques après
traitement par azithromycine

Objectif

   Déterminer l’impact d’un traitement par azithromycine sur le microbiote bactérien et viral digestif. L’impact sera évalué par comparaison entre un groupe de patients traités par azithromycine et un groupe de patients recevant un placebo.

Date de début : janvier 2018
Date de fin prévue : juin 2019

État d'avancement au 31/12/2019 et perspectives

A ce jour les analyses réalisées portent sur le microbiote par ARN 16S et la détermination du virome par NGS :

• Réalisation de librairies ADN et ARN pour détecter spécifiquement virus ADN et virus ARN. Diversesétapes ont été réalisées pour sensibiliser au mieux la détection des virus avant la réalisation des librairies. L’extraction des acides nucléiques totaux sur extraits de selles a été réalisée pour 164 échantillons de patients et 7 contrôles négatifs. Les selles ont été suspendues en PBS, centrifugées, filtrées sur 0.45 μm puis traitées par des nucléases pour éliminer
  des acides nucléiques libres afin d’enrichir en séquences virales. Les librairies ont été séquencées sur HiSeq avec les médianes de reads suivantes (séquences été classifiées sur Kraken2 selon Wood DE, Genome Biology 2014, 15:R46.) : 
        - Nombres d’espèces virales identifiées (génomes ADN et ARN confondus, ≥10 reads) : librairies ADN : 1136 espèces (66 familles, dont 6 de bactériophages, librairies ARN : 533 espèces (66 familles, dont 5 de bactériophages)
        - Proportion de bactériophages : librairies ADN : 88 % des reads viraux, librairies ARN : 4,4% des reads viraux.

Les travaux d’analyses et d’interprétation sont en cours.
 

DÉPISTAGE DU VIH-1 AU CONGO (2019-2020, AFRIQUE)

Titre : Etude de prévalence du VIH-1 au Congo

Objectif

      «Au-delà du prélèvement : Travailler pour apporter des services nationaux de haute qualité concernant le VIH et la tuberculose pour toutes les populations vulnérables en République du Congo » a pour objectif de réduire la mortalité liée au VIH et au Sida à travers d’une part la réduction des nouvelles infections dans les populations clés et au sein de la population générale et d’autre part, réduire la transmission du VIH de la mère à l’enfant. Les personnes vivant avec le VIH ont accès gratuitement aux suivis biologiques, consignés dans l’accord de subvention VIH/Tuberculose 2018-2020, financé par le Fonds Mondial.
      Les prélèvements sont réalisés par les Centres de Traitement Ambulatoires de Pointe-Noire et Brazzaville au Congo. Ils sont acheminés directement au laboratoire de l’hôpital Saint-Louis par un transporteur habilité et mandaté par la CRf, depuis les CTA.
      Afin de répondre au programme du fond mondial face aux difficultés locales du laboratoire national de la santé et face à l’urgence nous sommes intervenus à la demande de la CrF, récipiendaire du fond mondial, pour la réalisation des charges virales d’un large panel de plasma des patients de Brazzaville et de Pointe Noire. L’étude a été réalisée sur automate ROCHE 6800 au CHU Saint Louis de Paris. Mille patients ont été testés.
      Seuls 220 étaient indétectables. Les résultats - le plus souvent de charge virale élevée - reflètent une difficulté de suivi de traitement et ont été transmis au LNS pour une prise en charge adaptée des patients.

RÉSISTANCE DU VIH-1 AU CONGO (2019-2020, AFRIQUE)

Titre : Étude de prévalence de la résistance du VIH-1 au Congo

Objectif

• Évaluer la prévalence des résistances du virus VIH-1 chez les patients naïfs d’ARV au Congo Brazzaville.
• Évaluer la répartition des différents sous-types viraux.

Résultats

       En méthode Sanger 324 genotypes ont été rendus dont 302 avec résultats de la RT complets 284 auront été réalisés à Saint Louis pour soutenir le LNS. Pour EFV et NVP 10,3% à Pointe-Noire IC95%[5,70-15,03] et 5,8% à Brazzaville, IC95%[1,90-9,70]. Mais ces résultats ne préjugent en rien de résistance primaire. En effet, la présence d’INNRT lors des contrôles pharmacologique chez la moitié des patients présentant une résistance INNRT indique que le recrutement ne faisait pas complétement appel à des patients naïfs. D’où le peu d’intérêt de poursuivre cette étude par des examens moléculaires de type NGS. Le nomadisme médical justifié par la difficulté d’approvisionnement en ARV explique ces données de sujets souhaitant entrer en protocole pour bénéficier d’un accès simplifié à ces ARV. La répartition des sous-types viraux échantillon montre :
      A: 19.88 % [15.52;24.23]            B: 2.48 % [0.78;4.18]             C:2.80 %[0.99;4.60]
      CrF: 32.30 % [27.19;37.41]        D: 1.24 % [0.03;2.45]             F: 4.35 % [2.12;6.58]
      G: 21.74 % [17.23;26.24]            H: 7.76 % [4.84;10.69]          Recombinant complexe: 5.59 % [3.08;8.10]

   Ces résultats sont ceux attendus sur la diversité des souches et n’appellent pas de commentaires. Les analyses phylogénétiques confirment la grande diversité des souches comme attendu. Avec des souches dites ancestrales (A1) et peut être une relative organisation (non significative) autour de certains sous type comme le G. Le complément d’étude par NGS a été amendé compte tenu de l’absence de mutations de résistance dans la population étudiée et les limites du recrutement.
   Ces résultats seront l’objet d’une communication pour le prochain ICASA.
 

ÉTUDE REV (2019-2021, FRANCE)

Titre : Production de panels pour le diagnostic in vitro et l’évaluation de trousses diagnostiques

Objectif

   Le projet est basé sur la cession de souches VIH caractérisées moléculairement, constituant un panel de variants représentatifs de la diversité des VIH-1 et VIH-2 ; afin de valider les performances de la trousse Roche pour la quantification de l’ARN plasmatique du VIH. Il a consisté à typer des souches de variants divergents issues de culture ou d’échantillons cliniques, par séquençage Sanger.
   Dans le cadre de ce projet, nous avons cédé à la société Roche, 37 échantillons de surnageants, ainsi que 21 échantillons cliniques de sérum/plasma positif pour le VIH. La cession a été effectuée le 18 décembre 2019, envoi par avion.

ÉTUDE ROCHE (2019-2020, FRANCE)

Titre : Production d’échantillons d’intérêt pour le diagnostic in vitro

Objectif

   Le projet est basé sur la cession de souches VIH caractérisées moléculairement, constituant un panel de variants représentatifs de la diversité des VIH-1 et VIH-2 ; afin de valider les performances de la trousse Roche pour la quantification de l’ARN plasmatique du VIH. Il a consisté à typer des souches de variants divergents issues de culture ou d’échantillons cliniques, par séquençage Sanger.
   Dans le cadre de ce projet, nous avons cédé à la société Roche, 37 échantillons de surnageants, ainsi que 21 échantillons cliniques de sérum/plasma positif pour le VIH.

Date du projet

Du 1er aout 2019 au 30 septembre 2020 (date du contrat)

État d'avancement au 31/12/2019

La cession a été effectuée le 18 décembre 2019, envoi par avion.