02AUG

Activité référente en immunologie

ÉTUDE RÉGINFSEP (2011-2020, FRANCE)

Titre : Rôle du récepteur FcαRI dans le sepsis

Objectif

Déterminer si les souris exprimant le FcαRI humain sont capables de lier les bactéries cocci gram positifs et d'évaluer si cette interaction a ou non un effet immuno-modulateur dans deux modèles murin d'infection; un modèle de pneumopathie à S.pneumoniae et un modèle de CLP (ligature et perforation caecale) chez des souris transgéniques pour le récepteur FcαRl (FcαRl Tg).

Résultats

      Streptococcus pneumoniae et E.coli sont capable de lier directement (sans opsonine) le FcαRI recombinant, à la fois en solution et in vitro, et que cette interaction est inhibée par l'adjonction de FcαRI soluble recombinant. Nous avons également montré que l'adjonction de Streptococcus pneumoniae et E.coli sur des macrophages isolé à partit des souris transgéniques pour le FcαRI induit une activation cellulaire et une production de cytokines pro-inflammatoires. Cette activation est associée a un recrutement de la kinase Syk et non de la phosphatase SHP-1 au récepteur Fc RI. Des études complémentaire ont été effectué sur des cellules exprimant le FcαRIR209L(Récepteur incapable de se lier l'adaptateur Fcgamma ont démontré que cette activation cellulaire dépend du motif ITAM présent au niveau de la chaine gamma. Dans une seconde partie nous avons démontré que, dans les deux modèles murin de pneumopathie à Streptococcus pneumoniae et de CLP, la présence de Fc RI constitue un avantage de survie. Cette dernière est associée à une diminution des lésions histologiques et une moindre invasion bactérienne tissulaire. Au final nous concluons que la famille des Fc récepteurs est capable de lier des pathogènes de manière indépendante des opsonines. Le FcαRI pourrait ainsi avoir une fonction supplémentaire en agissant comme un senseur antibactérien. Ces expériences ont été confirmées dans un autre d’infection par E. coli. Dans le but d’exclure le rôle des ligands naturels du FcαRI telles que la CRP et l’IgA dans l’interaction FcRI/S. pneumoniae ou FcαRI/E.coli in vivo, nous avons établi une lignée de souris CRP knock-out (KO) et FcRITg. Ces souris ont montré que le FcRI est capable de protégé contre le sepsis en absence de la CRP et avant la mise en place de la réponse adaptative (avant la production des IgA anti-bactérie). Pour exclure le rôle d’IgA, nous avons établi une collaboration avec le service d’hématologie de l’hôpital Saint-Louis pour récupérer des patients CVID « Common Variable Immunodeficiency ». Les résultats ont montré que le CD89 exprimé par les leucocytes des patients CVID est capable de liè directement les bactéries soit Gram+ ou Gram- responsable de l’induction de l’activation cellulaire caractérisée par la production des cytokines, des formes réactives de l’oxygène et de la phagocytose.

Perspectives

      Développer des molécules favorisant l’interaction bactérie/récepteur dans le but d’améliorer la prise en charge des patients souffrant de sepsis et de compléter les traitements par antibiotiques.

Publications

    de Tymowski C, Heming N, Correia MDT, Abbad L, Chavarot N, Le Stang MB, Flament H, Bex J, Boedec E, Bounaix C, Soler-Torronteras R, Denamur E, Galicier L, Oksenhendler E, Fehling HJ, Pinheiro da Silva F, Benhamou M, Monteiro RC, Ben Mkaddem S. CD89 is a potent innate receptor for bacteria mediating host protection to sepsis. Cell reports, In press.

ÉTUDE N-IGA (2011-2020, FRANCE)

Titre : tester in vivo l’effet d’une protéase recombinante spécifique de l’IgA1 dans un modèle de néphropathie

Objectifs

1. Induire une infection à streptocoque pneumoniae chez la souris α1KI-CD89Tg, comparer la protéinurie, l’hématurie, l’insuffisance rénale et la formation de complexes immuns IgA1-Cd89s entre les souris infectées/non infectées pour étudier le rôle de l'infection bactérienne et/ou de la dysbiose, dans les poussées de N-IgA.
2. Explorer le rôle du complément dans une activation des cellules mésangiales secondaire à l’activation locale du complément, en particulier l’induction des voies MAP kinases, la sécrétion de cytokines proinflammatoires et la prolifération cellules.
3. Analyser les dépôts rénaux (cf partie II) chez la souris α1KI-CD89Tg versus α1KI-CD89TgCRP-/-. Cela permettrait de corréler la relation entre la CRP et l’activation du complément en analysant la présence de dépôts rénaux de C3b et de C5b9 par immunofluorescence.

Résultats

   L’invalidation de la CRP s’accompagne d’une diminution de l’hématurie, de la protéinurie et des dépôts mésangiaux d’IgA1.

Publication

Chemouny JM, Gleeson PJ, Abbad L, Lauriero G, Boedec E, Le Roux K, Monot C, Bredel M, Bex-Coudrat J, Sannier A, Daugas E, Vrtovsnik F, Gesualdo L, Leclerc M, Berthelot L, Ben Mkaddem S, Lepage P, Monteiro RC. Modulation of the microbiota by oral antibiotics treats immunoglobulin A nephropathy in humanized mice. Nephrol Dial Transplant. 2018 doi:10.1093/ndt/gfy323. [Epub ahead of print]

ÉTUDE INFGLO (2017-2020, FRANCE)

Titre : Immunorégulation de l’inflammation au cours des glomérulonéphrites

      Dans une étude récente, nous avons montré que deux src kinases, Lyn et Fyn contrôle la balance ITAM/ITAMi. Les souris invalidées pour la src kinase Lyn et transgéniques pour le FcαRIIA humain (Lyn-/-hFcαRIIATg) présentent une glomérulonéphrite sévère et létale associé à une phosphorylation inhibitrice de la phosphatase SHP-1 (résidu sérine 591) dans un modèle d'anti-GBM (anti-membrane basale glomérulaire). En revanche, les souris Fyn-/-hFcαRIIATg sont protégées dans ce modèle associé à une phosphorylation activatrice de SHP-1 (résidu tyrosine 536) au niveau des leucocytes. De plus, en collaboration avec les services de néphrologie et d’anatomopathologie de l'hôpital Bichat, nous avons effectué plusieurs études exvivo en utilisant les leucocytes circulants isolés à partir de sang qui montrent que chez les sujets sains, le FcαRIIA présente une signature ITAMi (association avec SHP-1 mais pas avec Syk) associée à un recrutement de Lyn mais pas de Fyn. Chez les patients atteints de GN lupique, ce récepteur présente une signature ITAMa (association avec Syk mais pas SHP-1) associée à un recrutement de Fyn. Cela est corrélé avec une diminution significative de recrutement de Lyn. (Ben Mkaddem et al, Nat Commun, 2017). L’ensemble de ces données suggère que le ciblage de ces deux Src présente un potentiel thérapeutique très fort. Cependant, il existe une homologie de 90% entre Lyn et Fyn. Identifier les molécules en amont et en aval de l’activation de ces deux Src kinase d’une manière spécifique. Nos expériences préliminaires, ont révélé l’implication d’une amino-peptidase dans l’induction du signal ITAM activateur dépendant de Fyn. De plus, les souris invalidées pour cet amino-peptidase sont protégées contre un modèle de glomérulonéphrite (Anti-GBM). L’invalidation de cette protéine protège et trait une autre maladie auto-immune « l’arthrite » chez la souris.

Objectif

   Le projet en cours concerne l’évaluation de l’effet de l’inhibition d’IRAP sur le contrôle de la balance ITAM/ITAMi et le développement de cette maladie sachant que l’inhibiteur spécifique est disponible.

ÉTUDE RENDO (2019-2021, FRANCE)

Titre : Rôle des endosomes dans l’activation des récepteurs aux fragments Fc des immunoglobulines (FcγR)

Objectives

       Signal-Fc project is based on preliminary data showing that the activating receptors for Fc fragment of immunoglobulins (FcRs) are signalling not only from plasma membrane, as previously thought, but also from endosomes described by Insulin-Responsive AminoPepidase (IRAP). These findings might change the view of the pathophysiology of immune complexes (IC) mediated-disease and can help to tailor the therapy of these diseases. The two main objectives of this project are :

• 1. To identify the endocytic routes by which the FcRs arrive to signalling endosome.
     To find out new factors associated to FcRs and IRAP endocytosis we need an unbiased assay. This assay will use the APEX2 peroxidase, fused to Fc RIIA (CD32a) and Fc RI (CD64). To obtain these constructs, we will replace the GFP moiety with APEX2 in our lentiviral plasmids coding for Fc R-GFP fusion proteins. The Fc R-APEX2 fusion constructs will be expressed via lentiviral vectors in DC2.4 DC-like cells. The control samples for the background of the assay will be DC2.4 cells expressing a cytosolic, soluble form of APEX2. In contrast to previously used enzymes for in situ biotinylation, APEX2 biotinylates only proteins that are in its proximity, less than 20 nm, being thus more specific than BioID or TurboID biotinylation systems, which use the BirA biotin ligase. In addition, due to long labelling time (18h), BirA can detect only stable interactions, while APEX2, which has a very short labelling time (1 min) can be used to identify highly dynamic interactions. Thus, identification of the proteins biotinylated by APEX2 will generate a real map of intracellular signalling environment of Fc Rs (collaboration with JP Camadro, mass-spectrometry platform of J Monod Institute).
• 2. To investigate if the endosomal signalling of activating Fc R is important in vivo
     Our preliminary unpublished results show that endosomal colocalization of p-Syk with Fc R is compromised in IRAPdeficient dendritic cell). Thus, IRAP-deficient cells and mice can be used to study in vivo the impact of endosomal
  FcR signalling in eliciting antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC). The cells responsive for ADCC in vivo are Macrophages (MF). MF will be obtained from the peritoneal lavage of wt and IRAP-deficient mice after i.p injection of thioglycollate 11. These cells will be used as effector cells in ADCC assays in which the targets will be several tumour cells expressing EGFR (HuCCT-1, EGI-1, Mz-ChA-1 et SK-ChA-1, kindly provided by Dr L. Fouassier) that will be preincubated with anti-EGFR antibody (IgG2a, clone 528). If these ex-vivo ADCC experiments will show a role for endosomal Fc R signalling, we will proceed to an in vivo assay using the murine melanoma cells B16 and the anti-gp75 monoclonal antibody TA99 that recognize the B16 melanoma. Wt and IRAP-deficient mice will be injected i.v with 105 B16 melanoma cells and with 200 g of TA99 or isotype control on day 2, 4, 7 and 9. At day 11, the number of lung metastases will be counted. In this protocol, wt mice are fully protected by ADCC 10.

Summary of work already accomplished:

• Objectif 1: The FcgRIIA and FcgRI receptors were already cloned in fusion with APEX2 and the production of lentiviral particules encoding them has started. We have already set-up in vivo biotinylation using soluble APEX2 and the purification of biotinylated proteins.
• Objectif 2: We have started the set-up of both in vivo and in vitro ADCC experiments. We have established in our animal facility the IRAPkoxRagko mouse strain that is under breeding now and will be soon used for the in vivo ADCC. Preliminary in vitro ADCC assays showed that IRAPko MFs are inefficient ADCC effectors.