Les Tests Virologiques du SARS-CoV-2

Les tests virologiques

 

La culture et l’isolement viral : le test de référence 

L'isolement du virus à partir d’un prélèvement prouve sa viabilité lors de ce prélèvement ; Mais ces techniques sont lourdes exigent un laboratoire expérimenté avec un niveau de sécurité de type L3. 

Et surtout la technique n’est que très peu sensible. Elle n’est en pratique utilisée que pour la recherche.

Ainsi 90 échantillons RT-PCR SARS-CoV-2 + ont été inoculés sur cellules Vero. Seuls 26 (30 %) ont montré une croissance virale. La DICT médiane 50/ml était de 1780 (282-8511). Absence de croissance pour les échantillons ayant un Ct > 24 ou collectés 8 jours après le début des signes. Jared Bullard et al Clinical Infectious Diseases, ciaa638, https://doi.org/10.1093/cid/ciaa638. 

Pour Roman Wölfel, Nature Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019 (2020). un taux d'isolement du SARS-CoV-2 de plus de 95%, il faut uniquement des prélèvement précoces c’est à dire collectés dans les 10 jours après le début des signes. 8,45-21,78) et aussi une charge virale de plus de 6,5 Log10 ARN / ml (IC à 95%: -4,11-5,40) 

Un autre papier s’adresse à la permissivité des différentes cellules. Avec l’avantage de donner beaucoup d’informations techniques des CDC pour réaliser la culture et les lames de fluorescence. Arinjay Banerjee https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/26/9/20-1495_article?deliveryName=USCDC_333-DM31126

Les cellules mononuclées du sang périphérique humain ne sont pas permissives pour le CoV-2-SARS. Qui peut pénétrer dans les lymphocytes T primaires CD4+ mais ne peut pas se répliquer efficacement.

 

Tests de recherche de l'ARN viral

Voir SARS-COV-2 DIAGNOSTIC PIPELINE trousses de détection de l’ARN ;

Fake news ! Il existerait de nombreux faux négatifs en PCR :

Gilbert Greub à l’Institut de microbiologie du CHU Vaudois Lausanne a réalisé plus de 14 000 tests PCR depuis le début de la pandémie. Sur ce total, seulement une quinzaine ont eu des résultats discordants alors qu’ils étaient prélevés à un ou deux jours d’intervalle. La qualité des prélèvements et le sérieux des laboratoires montrent que la PCR reste l’outil de base.

Institut de microbiologie

Les techniques classiques automatisées « Haut débit »

• Roche cobas® 6800 System et 8800 System : ce test est un test RT-PCR en temps réel qui permet la détection qualitative du virus dans des échantillons d'écouvillons nasopharyngés et oropharyngés ; résultats en trois heures et demie. Attention seuls les laboratoires équipés des automates 6800 (les hôpitaux) ou 8800 (CTS et labos privés types Cerba) peuvent réaliser le test. Traite jusqu'à 384 (cobas® 6800) et 960 tests (cobas® 8800) dans un délai de 8 heures. En pratique optimale (!) jusqu'à 96 résultats en moins de 3,5 heures*, puis 96 résultats supplémentaires toutes les 90 minutes pour cobas® 6800 (et toutes les 30 minutes pour 8800). Les automates sont construits en Suisse mais le test produit aux USA ; c’est une RT-PCR en temps réel multiplex avec 2 cibles et un contrôle interne : -le gène ORF1 (target 1) -le gène E panSarbecovirus (target 2) ;
• Abbott m2000TM System et Alinity (mai) ; l'amplification des trois cibles (SARS-CoV-2 RdRp, SARS-CoV-2 N et IC) a lieu simultanément dans la même réaction. Les séquences cibles pour le test Alinity sont dans les gènes SARS-CoV-2 RdRp et N du génome du SARS-CoV-2 ;
• Hologic Panther Fusion® System ;
• GeneXpert® Infinity System : une référence mais nécessite un automate spécifique qui peut réaliser de 3 à 6,12, 24 ou plus selon le nombre de module. Proposé à 20 U$ le point pour le fond mondial. Qualitatif l’AP HP est livré mais compte goutte ;
• NeuMoDxTM 288 Molecular ;
• L’automate Qiastat peut rendre un résultat en 1h unitaire et détecte 11 autres pathogènes respiratoires. Utile aux SAU ;
• Le test unitaire SARS-CoV-2 BioFire COVID-19 est disponible en quantité limitée pour happy few.

LES TESTS COMMERCIAUX ADAPTABLES SUR CHAÎNE OUVERTE

• Altona largement utilisé donne de bons résultats ;
• ARGENE® SARS-CoV-2 R-GENE 2 gènes s RdRp gène et N-gène (bioM aurait décuplé sa production) CE-IVD ;
• Atila iAMP® COVID-19 Detection Kit, iAMP-COVID-100-RUO De Fujirebio Inno LiA (isotherma-PCR l à partir directement de l’ARN de l’écouvillon, pas de procédures d’extraction ; gène N et de l'ORF-1ab du SRAS-CoV-2 ;
• PrimeDirect Probe RT-qPCR de Takara Bio sans étape d’extraction en 35 - 45 minutes sur ENP, EOP et salive. Proposé à 1,5 € le point (à contrôler).

LES KITS COMMERCIAUX ASIATIQUES OU LES TECHNIQUES MAISON permettent de rendre un résultat en 3-4h. Des centaines sont proposés. A éviter si pas de validation nationale.

LES TECHNIQUES DITES MAISON (PCR test ‘’Allemand’’ de Drosten ou Pasteur ou autres) doivent être manipulés avec soin uniquement par des laboratoires expérimentés en raison des risques de contaminations des tests donnant de faux positifs. 

Les laboratoires moins équipés, moins expérimentés et avec un moindre débit pourront s’orienter vers les automates types Qiastat ; E pLex, bioFIre, Cepheid.., unitaires. Et qui donnent les co-infections simultanément. Parfois cher (>100 euros le test).

Si les laboratoires sont déjà équipés en Cepheid GenXpert, le test est disponible réalisable en 45 mn.

D’autres automates font leur apparition sans cesse. Mais il faut rester sur du connu. Surtout pour l’Afrique pour assurer la distribution.

Les tests rapides moléculaires pour l'ARN

Vont détecter de façon unitaire l’ARN des écouvillons. Un grand avenir car ils seront sensibles dans le même ordre que les tests actuels et permettent un diagnostic dès les urgences. Un petit automate est nécessaire.

1 - ID NOW COVID-19 Test : Détecte l’ARN en 5 mn en cas de positivité et 13 mn pour un résultats négatif. La technique est la plus rapide basée sur un système isothermal. Abbott vise 50 000 tests par jour en production. 

2 - Biosynex France commercialisera un test développé par la société singapourienne Credo Diagnostics Biomedical basé sur le même principe.

3 - Bfiocure : idem cette fois le résultat promis en... 10 mn

Avec leur système Chronos. Retenu par l’armée française Nomorecov « l’évaluation Nomorecov » devrait aboutir à un premier prototype dans six mois. Il sera testé par le laboratoire de virologie de l'hôpital Saint-Louis à Paris.

 

4 - En recherche Française : le test EasyCov à partir d’un écouvillon et de réactif mis à 65° pendant 30 mn lisible à l'œil nu a déjà permis de détecter de l'ARN viral isolé en laboratoire et du virus actif donc à très haute concentration. Sys2Diag, du CNRS et CHU de Montpellier.

La technique RT-LAMP permet d’amplifier l’ARN dans un échantillon salivaire chauffé une heure à 65 °C grâce à un système nomade avec une lecture colorimétrique. L’étude (n = 180 patients) a été réalisée en double aveugle. Les premiers résultats pour 93 soignants asymptomatiques montrent peu une spécificité de 95,7 % et sensibilité de 72,7 % (Prépublication sur la plateforme « medRxiv );Pr2vu pour juin CE IVD par Skillcell pour 20€. doi: Nicolas L'Helgouach in https://doi.org/10.1101/2020.05.30.20117291

5 - SARS-CoV-2 DETECTR (~30 min) CRISPR-Cas12 based lateral flow assay à partir des écouvillonages et d’une extraction ARN.

Rapid Detection of 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based DETECTR Lateral Flow Assay

Les multiplex à venir :

A cette heure, les tests syndromiques sauf Qiastat ne sont pas encore modifiés pour reconnaître le SARS-CoV-2 et le seront dans les mois à venir.

Le test IRV (infections respiratoires virales) de la plateforme Vivalytic de Bosch permet de détecter dans l’échantillon prélevé chez le patient la présence du virus SARS CoV-2, ainsi que celle de neuf autres virus respiratoires, en 2,5 heures et de manière entièrement automatisée.

La société bioMérieux développe aussi une nouvelle version étendue de son panel respiratoire 2 BIOFIRE® FILMARRAY® (RP2) : le panel BIOFIRE® RP2.1. Ce nouveau panel intégrera le SARS-CoV-2 en plus des 21 pathogènes les plus fréquemment responsables d’infections respiratoires qu’il permet déjà de détecter en environ 45 minutes. Ces deux tests BIOFIRE® seront soumis aux autorités réglementaires aux deuxième et troisième trimestres 2020, respectivement ; leur lancement aura lieu immédiatement après l’obtention des autorisations de mise sur le marché.

La quantification de la charge virale : attention on l’exprime en CT (Cycle Threshold) ce qui doit être bien compris alors que les PCR se basent sur des dilutions donc sur un calcul en logarithme. CT correspond au point seuil pour lequel le signal est supérieur au bruit de fond, c'est-à-dire au nombre de cycles minimal pour lequel l'ADN amplifié est détectable. Ce point est atteint en début de phase exponentielle. Plus la quantité d'ADN initiale sera faible, plus le CT sera élevé. Plus le CT est bas (ie 16,18 cycles ) plus la quantité d’ADN (donc après rétro-transcription dans le cas des virus ARN) dans l’échantillon est importante. Inversement plus le CT est élevé, moins il y a d’ADN et surtout moins la PCR est répétable. Au-delà de 35 CT il faut oublier la valeur « quantitative » de la PCR et interpréter avec prudence le résultat.

Les cliniciens sont habitués à faire confiance à leur virologue pour interpréter les résultats et se reposent sur l’idée de qualité des tests HIV HVC etc.. Mais un prélèvement sanguin hautement standardisé et répétable ne peut être comparé à un écouvillonnage.

High-throughput SARS-CoV-2 détection via qPCR

Takara Bio propose une SmartChip Real-Time PCR System, pour amplifier les coronavirus. Reste à voir la sensibilité et l’intérêt compte tenu de performances des grosses cylindrées.

Plusieurs protocoles NGS sont validés pour la génération de génomes complets à partir d'échantillons primaires par séquençage MinION ou MiSeq https://doi.org/10.1101/2020.04.02.20051417External Link; X. Deng et al., unpub. data, https://doi.org/10.1101/2020.03.27.20044925External Link; M. Worobey et al., unpub. data, https://doi.org/10.1101/2020.05.21.109322External Link). 

Tests de recherche directe des antigènes sur la salive

Voir SARS-COV-2 DIAGNOSTIC PIPELINE trousses de recherche des antigènes.

Le pire et le meilleur...

Attention aux tests de détection des antigènes sur les écouvillons nasopharyngés ou par auto-prélèvements de gorge. Ces test rapides venant de Chine ou du Sud-Est asiatique sont peu fiables et non recommandés par l’OMS : WHO does not currently recommend the use of antigen-detecting rapid diagnostic tests.

Une mine d’or exploitée par les fabricants, parfois peu scrupuleux sur la qualité des test, consiste à remplacer la PCR par un « docteur test » comme ceux décrits plus hauts détectant les anticorps mais ayant cette fois la prétention de détecter les antigènes du virus. Mais les méthodes de détection des antigènes sont compliquées et peu sensibles. Ils visent une utilisation en Afrique ou dans des contextes d’accès aux soins ou au diagnostic difficiles. La sensibilité attendue est de 60 % seulement.

Quelques exemples à la lettre A : AmonMed Biotechnology Co., Ltd COVID-19 Antigen Test Kit (Rare Earth Nano Fluorescence Immunochromatography) (CE-IVD) ; Abwiz Bio RabWiz Ultra Sensitive COIV-19 Viral Antigen Test Kit; Academia Sinica SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Rapid Detection Kit; AmonMed Biotechnology Co., Ltd COVID-19 Antigen Test Kit (Rare Earth Nano Fluorescence Immunochromatography) (CE-IVD). qui n’hésite pas à s’intituler CE IVD... Pour les suivants allez sur le site FIND.

Mais peut être demain une solution de tri rapide avec des nouveaux tests de détection des antigènes plus performants ?

L’objectif de ces tests sera d’obtenir une sensibilité supérieure à 90 % et d’apporter un résultat en 15 minutes avec une manipulation très simple. Exportables sur tous les terrains et dans des conditions même difficiles, ils pourraient aussi être utilisés par les patients eux-mêmes (home test).

De plus, leur positivité traduisant la production d’antigène, elle témoignerait donc de la présence d’un virus vivant, réplicatif (capable de se multiplier).

Le BARDA (Biomedical Advanced Research and Development Authority ) vient de mandater la plate-forme OraQuick® d’OraSure pour un auto-test ou par les professionnels de la santé de détection de l’antigène salivaire. A partir d’un échantillon de fluide oral (liquide créviculaire) pour des résultats en 20 minutes. Aucune instrumentation ni personnel qualifié ne serait nécessaire. Serait disponible d’ici 4 à 6 mois pour les coronavirus SARS-CoV-1 et 2.

Le test COVID-19 d'ArcDia® est un test finlandais utilisable sur la plateforme mariPOC®. Il est associé à un service épidémiologique utilisant le Cloud. Ce test est basé sur la technologie ArcDia™ TPX (Two-Photon Excitation) assay. La technologie utilise la détection d’antigènes sur microparticules par une méthode de fluorescence excitée par laser, la quantité de fluorescence mesurée étant proportionnelle à la quantité d’antigène présente dans l’échantillon prélevé.

La société a l’expérience de la détection des coronavirus : elle produisait déjà un test multiplex pour pathogènes respiratoires.

Luminostics développe un autotest avec détection chimioluminescence de nanoparticules via l'optique du smartphone : ce ne sont pas des loustic, c’est sérieux soutenu par Sanofi. Reste à évaluer.

E25Bio start up US fondée en 2018 au MIT, nanoparticules pour capturer et détecter les protéines virales sécrétées dans les fluides oraux et respiratoires des SARS CoV-2. Expérience passées avec Zika et dengue. Viennent de recevoir USD 2 millions pour commencer les tests. En 15 - 20 minutes.

Diao et Al Diagnosis of Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infection by Detection of Nucleocapsid Protein Test immunochromatographique par fluorescence pour 239 participants dans 7 centres : protéine de la nucléocapside dans des échantillons nasopharyngien en parallèle avec PCR en 10 minutes. 100% des participants positifs et négatifs vs PCR. Etude préliminaire complémentaire détecte la protéine de la nucléocapside dans l'urine de 73,6 % des patients diagnostiqués covid 19.

Tests de recherche des anticorps

« No test is better than a bad test » M. Busch April 20 » : Lire ici

Il s’agira probablement d’une réponse locale pulmonaire de type sécrétoire Ig A de durée plus ou moins réduite. La présence d’Ig M et Ig G après le switch isotypique est aussi possible. Toutes les études bien conduites montrent que l’on est dans une infection classique quant à la dynamique d’apparition des anticorps : Ig A & Ig M puis Ig G vers 10-15 jours au plus tard 21 jours. La seule question est le taux d’anticorps et leur détectabilité chez les asymptomatiques ou paucisymptomatiques et surtout le manque de sensibilité des tests (surtout les tests rapides) pour détecter ces populations. Et de leur durée dans le temps mais l’expérience montrent la permanence des Ig G sur des années y compris pour les virus respiratoires pour autant que les tests soient sensibles. Et des patients SARS-CoV de 2003 ont encore des Ig G.

Recommandations HAS pour la sérologie 

La HAS recommande que les tests soient évalués par le Centre national de référence des virus des infections respiratoires avant tout achat ou utilisation 

FS : il suffit de se reporter au site FIND qui collige l’ensemble des données internationales ; Et cela va vite... les données de sensibilité et spécificité avancées par le fabricant ne peuvent être validées que par une évaluation externe. A peine plus d’une dizaine ont la capacité de répondre aux attentes que ce soit la détection de l’ARN ou la détection des anticorps. La liste des tests disponibles est vertigineuse et ne répond à aucune logique de qualité.

Le site FIND tient à jour ce listing. SARS-COV-2 DIAGNOSTIC PIPELINE 

Un point très complet du John Hopkins Hosp sur le diagnostic sérologique aux USA et les tests FDA+

Tests that have been approved for diagnostic use in the United States

Les tests sérologiques ne sont pas recommandés dans le cadre du diagnostic précoce de l’infection covid 19 lors de la première semaine suivant l’apparition des symptômes.

- Les tests sérologiques ne permettent pas de statuer sur la contagiosité de la personne.

- Les tests sérologiques permettent uniquement de déterminer si une personne a produit des anticorps en réponse à une infection par le virus SARS-CoV-2.

- La cinétique de production des anticorps contre le virus est encore aujourd’hui mal caractérisée, principalement chez les patients asymptomatiques. La durée de protection éventuelle est également mal connue.

- C’est pourquoi, la HAS propose un cahier des charges qui détaille des critères de qualité et d’exigence vis-à-vis de l’ensemble des tests sérologiques détectant les anticorps spécifiques dirigés contre le SARS-CoV-2 afin de faciliter leur développement et leur évaluation.

Les valeurs prédictives des tests

- La HAS considère que les valeurs seuils minimales sont estimées à 98% pour la spécificité clinique et à 90% ou 95% selon l’usage du test pour la sensibilité clinique

FS : ces valeurs sont insuffisantes d’autant que les évaluation de la plupart de ces test sont très limitées surtout pour les test rapides qui présentent de grandes variabilités inter lots.

Pour calculer la probabilité, il faut une approche Bayésienne qui incorpore les informations sur la situation du sujet et la précision du test. 

Pour un test négatif, il existe deux entrées clés : la probabilité du pré test - une estimation, avant le test, des risques d'infection de la personne - et la sensibilité du test. La probabilité du pré test va dépendre de la prévalence locale de covid 19, des antécédents d'exposition au SRAS-CoV-2 et des symptômes. Idéalement, la sensibilité et la spécificité cliniques de chaque test seraient mesurées dans diverses situations réelles pertinentes sur le plan des risques. Par exemple avec un test parfaitement spécifique et une probabilité de pré test pour quelqu'un symptomatique après un contact étroit avec un Covid de 20% et une sensibilité du test de 95%, la probabilité d'infection post-test avec un test négatif serait de 1%. Si la probabilité de pré test était aussi élevée que 50%, la probabilité de post-test resterait inférieure à 5%. Mais hélas la méta analyse réalisée par le groupe FIND sur les tests rapides suggère que 70% de sensibilité est une estimation raisonnable avec ces tests. À ce niveau de sensibilité, avec une probabilité de pré test de 50%, la probabilité de post-test avec un test négatif est de 23% donc totalement inacceptable pour gérer une politique de santé publique. S. Woloshin, N. Patel, and A.S. Kesselheim in False Negative Tests for SARS-CoV-2 Infection — Challenges and Implications. DOI: 10.1056/NEJMp2015897 | June 5, 2020

La ligne bleue représente un test avec une sensibilité de 70%, la ligne verte un test avec une sensibilité de 90%. L'ombrage rosé est le seuil pour considérer avec 95% de probabilité qu’une personne n'est pas infectée (5%). La flèche A indique qu'avec le test de sensibilité 70%, ce seuil ne peut pas être atteint si la probabilité du pré test dépasse 15%. La flèche B indique que pour le test de sensibilité supérieure, le seuil a la une probabilité de pré test d'environ 33%. Une version interactive de ce graphique est disponible sur NEJM.org. DOI: 10.1056/NEJMp2015897 | June 5, 2020.

Le graphique montre comment la probabilité d'infection post-test varie avec la probabilité de pré test pour les tests avec une sensibilité faible (70%) et élevée (95%). La ligne horizontale indique un seuil de probabilité en dessous duquel il est raisonnable de considérer la personne comme non infectée (par exemple, autoriser la personne à rendre visite à un EHPAD). Ce seuil est fixé ici, 5% de risque et peut varier selon le contexte. Un résultat négatif avec un test de faible sensibilité peut être considéré comme vraiment négatif avec 95% de certitude lorsque la probabilité d’infection de pré test est < 15%.

Le graphique souligne aussi l’importance des conditions épidémiologiques et l’importance des mesures barrières. Avec un test plus sensible, on peut alors garder cette assurance de vrai négativité à 95% même si le risque de contamination pré test des de 33%. D’où dans le contexte actuel de maîtrise de l’épidémie et de faible prévalence il est impératif de travailler avec des tests de hautes sensibilités.

La foire aux tests sérologiques

Des centaines de trousses déferlent sans contrôle sérieux. Anarchie totale et on redira avec M Bush.

« No test is better than a bad test »

Voir SARS-COV-2 DIAGNOSTIC PIPELINE des trousses de recherche des anticorps.

Une poussée de fièvre jaune y compris pour les gros automates : Yhlo, MGI, Daan Gene, Snibe côté chinois, Seegene Genolution ou SD Biosensor côté coréen... difficile de recenser ces nouveaux arrivants, dont les noms nous sont inconnus lesquels leurs distributeurs français (eurobio...) restent discret. Et comme ils ont tous un distributeur européen et s'auto accorde leur CE IVD...

L’éditorial de Nature du 18 04 est clair : certains tests anticorps commerciaux ont des spécificités de 40% en début d'infection. Dans une analyse de 9 tests commerciaux disponibles au Danemark, 3 des sensibilités allant de 67 à 93% et des spécificités de 93 à 100%. Dans la même étude, cinq tests sur six des sensibilités allant de 80 à 93% et une spécificité de 80 à 100%. Certains kits sont testés sur moins de 30 personnes. Lassaunière, R. et al. Preprint at medRxiv Evaluation of nine commercial SARS-CoV-2 immunoassays (2020).

Selon l’Arrêté du 20 mai la commercialisation des tests sérologique SARS-CoV-2 en France est limitée aux dispositifs marqués CE ET inscrits sur la liste publiée sur le site internet du ministère de la santé (https://covid-19.sante.gouv.fr/tests). Les exigences de la HAS ont été publiées le 16 04 : la présence d’un marquage CE, la valeur seuil minimale de la sensibilité de 90% ou 95% en fonction de l’usage du test, une valeur seuil minimale de spécificité clinique de 98 %. 

https://www.has-sante.fr/jcms/p_3179988/fr/covid-19-la-has-definit-les-criteres-pour-evaluer-la-fiabilite-des-tests-serologiques

Les grands tests sur automate : les plus sensibles et plus spécifiques

1 - Le test Diasorin fabriqué et évalué en Italie pourrait permettre du débit semi rapide. Il détecte les anticorps Ig G anti S1 et S2. Il dispose du marquage CE et disponibilité du kit fin avril en France mais jusqu'à fin juillet, en disponibilité limitée. Des plateformes automatisées Liaison XL (170 sérum /heure) permettent d’envisager des séries de plusieurs centaines d’échantillons par jour. Les évaluations ont été faites en Lombardie et Diasorin est reconnu pour son sérieux dans la production des kits de diagnostic. C’est le premier test ELISA de fabrication européenne qui peut inspirer confiance mais sa production va être très limitée et la demande très forte; Il serait idéal pour les études ponctuelles : épidémiologie, personnel Ehpad et soignants

2 - Le test anticorps Ig G Abbott :

Abbott est excellent et permet de grande série. Il est utilisé par les laboratoires de CHU et par CERBA.CERBALLIANCE. Mais ne fait que les Ig G pour l’heure. L’antigène utilisé est celui de la NUCLEOCAPSIDE N.

Ces tests fonctionnent sur les Architect i2000. Fin juin, ces tests seront ensuite disponibles sur les automates Alinity : 

Les 1ères semaines, les calibrants et contrôles seront rationnés (1 boite tous les 21 jours par paire d’Architect). Abbott annonce une production de 100 000 tests / semaine pour la France puis très rapidement 1 M de tests. Ils sont fabriqués en Irlande. 5 euros HT le test (calibrant : 115, contrôle 92).

• Le test est de bonne qualité : la sensibilité à 10 jours est de 93% et 100% à 14 jours (sur 90 patients hospitalisés et 30 guéris) ;
• La spécificité sur 1000 personnes > 99,5% ;
• CV < 3%.

ABBOTT va recenser les estimations de consommations par semaine des différents laboratoires concernés (à l’APHP et en France). Ensuite, le surplus sera envoyé dans d’autres pays, d’où l’intérêt de disposer d’une stratégie nationale de tests : seulement les patients et le personnels de hôpitaux/EHPAD ou toute la population à terme. Existe-t-il une immunité ? et combien de temps ?

• Roche Elecsys® Anti-SARS-CoV-2 Ig G pour sérum et plasma humains entièrement automatisés résultats en environ 18 minutes, avec un débit de test allant jusqu'à 300 tests/H ; Test sandwich détecte donc tous les isotypes mais ne les différencie pas.utilise un format Double Antigene Sandwich en une étape. L’antigène utilisé est une protéine recombinante de la nucléocapside (N). La spécificité du test évaluée sur un panel de 5 272 échantillons est de 99,81% avec un intervalle de confiance a 95% bas de 99,65%. Un panel de 40 échantillons provenant d’individus infectés et confirmés par PCR par les 4 coronavirus communs NL63, 299E, HKU1 et OC43 (ces 2 derniers étant du groupe β comme les coronavirus du SARS et du MERS) a été teste et tous les échantillons ont donné un résultat négatif. Les donnés de sensibilités sont résumées ci-dessous ; l’ensemble de ces résultats est communiqué par Roche. 

• Pour Siemens, en attente pour les plateformes Atellica® Solution et ADVIA Centaur® XP/XPT/CP.
• Beckman, en attente pour l’automate haut débit tests fabriqués en France ce qui évitera un embargo US l’automate UniCel DxI 800 Access permet 400 tests /heure. L’antigène utilisé est le spike S. Premières évaluations à St Antoine. Déjà FDA approved et en attente de réponse du CNR pour la France.

YLHO iFLASH Chemiluminescence : automate chinois selon le débit de 180 à 300 par heure.

Eurobio Scientific SARS Cov-2 Ig G et Ig M CLIA sur MagLumi COVID-19 fabriqué par SNIBE (Chine) 0 à 280 échantillons par heure.

Les tests EIA en plaques semi manuels

Test EIA 96 puits distribué en France :SARS-CoV-2 virus lysat purifiés comme antigène ELISA kits indirect pour les Ig G et par immunocapture pour les ig M: GENOMIC VISION Green Square Bâtiment E 80-84 rue des Meuniers 92220 Bagneux - France Tél. (33) 1 49 08 54 41Tél (33) 6 81 87 37 91www.genomicvision.com

• Test EIA 96 Orgentec ;
• Test EIA 96 EuroImmun Ig A et I g G ; Antigène S
• EPLEX-SARS-COV-2 PANEL KIT RUO 12 TESTS de la société Elitech ;
• COVID-19 IGG ELISA DIAPRO 192 TESTS, COVID-19 IGM ELISA DIAPRO 192 TESTS et COVID-19 IGG CONFIRMATION ELISA DIAPRO de Launch Diagnostic ;
• etc... / Rien de validé pour l’heure.

LES TEST ELISA UNITAIRES

Le VIDAS® anti-SARS-CoV-2 Ig M et anti-SARS-CoV-2 Ig G donc un système type Nespresso et qui doit permettre une approche unitaire de qualité vues les antécédents de bioMérieux. L’avantage est la rapidité et aussi la présence de Vidas dans de très nombreux laboratoires (30 000 de par le monde) ce qui assure un accès à un test de qualité dans pas mal de pays y compris ceux très démunis.

Les tests VIDAS-SARS-COV-2-IgG et VIDAS-SARS-COV-2 IgM sur VIDAS® 3, VIDAS® PC et MINIVIDAS® sont CE-IVD et devraient être des tests sérologiques fiables compte tenu du délai de développement de 6 semaines et de l’expérience de bioM et produits en France. Les résultats sont obtenus en en 27 minutes avec 100 microL de sérum ou plasma sur la détection de Spike par les anticorps évalués sur 190 échantillons de patients PCR positifs et sur 989 échantillons négatifs(prélevés avant septembre 2019) pour les IgG. tests IgM et IgG ont montré respectivement une spécificité de 99,4% et 99,9%. Quant à leur sensibilité, pour les anticorps IgM, elle était de 90,6 % à partir du 8e jour et de 100 % à partir du 16e jour après une PCR positive, et pour les anticorps IgG, elle était de 88,6 % (8e jour) et 96,6 % (15e jour) combinaison des résultats des tests IgM et IgG. Ils ont révélé 96,4 % de sensibilité à partir du 8e jour et 100 % à partir du 15e jour. (données bioM). L’antigène utilisé est le spike S.

Les tests rapides

Il faut impérativement sortir du piège des tests rapides. De fait ils ne servent à presque rien sont chers peu sensibles (cf FIND et leur méta analyses 60-70% de sensibilité et 90 % de spécificité). Voir ci dessus.

Voir SARS-COV-2 DIAGNOSTIC PIPELINE trousses de recherche des anticorps ou des antigènes et les évaluations internationales

https://www.finddx.org/covid-19/pipeline/?section=immunoassays#diag_tabhttps://www.finddx.org/covid-19/pipeline/?section=immunoassays#diag_tab

Le 8 avril, WHO recommends the use of these new point-of-care immunodiagnostic tests only in research settings

ATTENTION : Avis du CNBM 14 avril : la Commission nationale de biologie médicale recommande de n’autoriser que des tests rapides d’orientation diagnostique (TROD) et examens de biologie (RT-PCR ou trousses Elisa) dont les techniques ont été validées par les CNR). Tout usage de tests ou examens non validés par les CNR devrait être interdit. La CNBM souhaite la publication de textes réglementaires.

ATTENTION : Les tests rapides de détection des anticorps anti-SARS-Cov-2 disponibles en France sont pour la plupart importés de Chine. Les contrôles de qualité de production ont des marges de tolérance importantes voire inexistantes.

ATTENTION : les tests rapides ne disposent pas de contrôle de réaction. Ils ont tout au plus un contrôle de migration de l'échantillon sur la bandelette car comme indiqué sur le schéma ci dessous l’or colloïdal va se fixer sur la dernière bande C indiquant qu’il y a bien eu migration mais il n’y a aucun témoin qu’une réaction immune antigène anticorps a bien eu lieu.

ATTENTION : la lecture s’apparente souvent à de l’art divinatoire. Avec la CQ et les TDR Le COVID 19 et décidément ancrée dans la pensée magique.

ATTENTION : un test rapide va mobiliser les anticorps de 15 microL de sang total soit 7,5 à 10 microL de plasma alors qu’un test ELISA réalisé partir d’une prise de sang au pli du coude va tester la présence d'anticorps sur un volume de 100 à 200 microL de plasma. Chercher la différence.

ET SURTOUT ATTENTION AUX VALEURS PRÉDICTIVES

Recommandations pour la sérologie HAS

La HAS recommande que les tests soient évalués par le Centre national de référence des virus des infections respiratoires avant tout achat ou utilisation.

FS : il suffit de se reporter au site FIND qui collige l’ensemble des données internationales ; Et cela va vite... les données de sensibilité et spécificité avancées par le fabricant ne peuvent être validées que par une évaluation externe. A peine plus d’une dizaine ont la capacité de répondre aux attentes que ce soit la détection de l’ARN ou la détection des anticorps. La liste des tests disponibles est vertigineuse et ne répond à aucune logique de qualité. Le site FIND tient à jour ce listing.

SARS-COV-2 DIAGNOSTIC PIPELINE 

Les tests sérologiques ne sont pas recommandés dans le cadre du diagnostic précoce de l’infection covid 19 lors de la première semaine suivant l’apparition des symptômes.

- Les tests sérologiques ne permettent pas de statuer sur la contagiosité de la personne.

- Les tests sérologiques permettent uniquement de déterminer si une personne a produit des anticorps en réponse à une infection par le virus SARS-CoV-2.

- La cinétique de production des anticorps contre le virus est encore aujourd’hui mal caractérisée, principalement chez les patients asymptomatiques. La durée de protection éventuelle est également mal connue.

 - C’est pourquoi, la HAS propose un cahier des charges qui détaille des critères de qualité et d’exigence vis-à-vis de l’ensemble des tests sérologiques détectant les anticorps spécifiques dirigés contre le SARS-CoV-2 afin de faciliter leur développement et leur évaluation.

- La HAS considère que les valeurs seuils minimales sont estimées à 98% pour la spécificité clinique et à 90% ou 95% selon l’usage du test pour la sensibilité clinique.

Quelques produits exemples ni pire ni meilleurs : 

Voir le listing FIND sur les performances des trousses et leurs évaluations. 

• Voir SARS-COV-2 DIAGNOSTIC PIPELINE trousses de détection de l’ARN ;
• Voir SARS-COV-2 DIAGNOSTIC PIPELINE trousses de recherche des anticorps ou des antigènes.

*1er test FDA Approved : CELLEX qSARS-CoV-2 IgG/IgM Rapid Test (chine) Positive Percent Agreement of 93.75% (95% CI: 88.06-97.26%) and Negative Percent Agreement 96.40% (95% CI: 92.26-97.78%), 

Mobidiag (HQ) : Anti-SARS-CoV-2 détecte les Ig G et Ig M dans le sérum, le sang ou le plasma en 15 minutes environ. Fabriqué par Autobio Diagnostics partenaire de Mobidiag 172 rue de Charonne 75011 Paris adv@mobidiag.com

PHarmact idem propose les seuils de sensibilité suivants :

• Stade précoce 4-10 j : Ig M 70 % ;
• Stade tardif Ig M 11-24 : 92.3% et Ig G 98.6%.

Hardy diagnostic

A priori double piste IgG et IgM pour sérum, le sang ou le plasma en 15 minutes environ. La double piste permettant de différencier les réponses IgG et IgM est un plus. Sensibilité et spécificité seraient supérieures à 96 % selon le fabricant.

COVID-PRESTO® IgG/IgM est marqué CE par AAZ - Nephrotek

En 10 minutes, à partir de 10 μl de sang au bout du doigt, le test montre une positivité entre J8 et J21 après l'apparition des premiers symptômes pour l'ensemble des patients testés (résultats préliminaires de deux études d'évaluation actuellement en cours en France). AAZ 43 rue de Bellevue ; 92100 Boulogne-Billancourt ; www.covid19aaz.com

NG-Test IgG-IgM COVID-19 de la société bretonne NG Biotech avec les honneurs de la presse : en 15 minutes pour détecter et différencier Ig G et M. premiers essais encourageant mais à transformer en production industrielle. Avec son « auto piqueur » pour collecte du sang capillaire... Chic.

BioSpeedia, développe une technique rapide par immunochromatographie. Une première étude menée sur 146 sérum montrerait une spécificité de 98,1 à 100% et une sensibilité de 95,5 à 100%.

STANDARD Q COVID-19 IgM/IgG Duo (SD BIOSENSOR) distribution par Orgentec.

DiaQUick Ig G et M : Aximed Route de Chirassimont. Chez Jeannot 42470 Fourneaux.

Test mis au point par la plate-forme sénégalaise Diatropix de l’Institut Pasteur de Dakar, en partenariat avec la société sénégalaise MOLOGIC.

St George's University Londres et Liverpool School of Tropical Medicine montrent des données préliminaires de performance clinique d'une sensibilité de 98% aux jours 14-21 et d'une spécificité de 96% pour la détection de l’antigène salivaire.

Le test fournira une indication sur la présence d'anticorps covid 19 (Ig A, Ig M et Ig G) dans un délai de 10 mn. Mologic est actuellement en train d'affiner une variante "stripped-down" (?)

En association avec l’IP de Dakar qui devrait produire les tests localement. Sous l’appellation Diatropix.

Et des centaines de tests tous basés sur de l’immunochromatographie et proposant des détection Ig G et Ig M à partir du sérum et du sang total. A retrouver sur la liste FIND. Sur la base des expériences acquises lors des infections par HIV et Hépatites il ne faut pas attendre de sensibilités ni spécificité correctes des ces tests non évaluées ; Le marquage CE une fois de plus ne veut rien dire. Idem FDA en Emergency Use Authorization (EUA) ne vaut guère plus. Seules les évaluations à grande échelle avec des fabricants capables d’assurer une standardisation des lots, d’assurer production et distribution.

Au Royaume Uni ,3.5 millions d'autotests du coronavirus en 15 minutes, devaient être distribués aux citoyens... mais les autorités se rendent compte à temps que les tests rapides ne sont pas évalués correctement et reviennent sur leur décision. Idem l’Espagne a retourné ses commandes au fabricant.

Il semble que l’Armée Française ait craquée pour l’achat massif de test. A priori « nationaux ». Peut être l’occasion d’avoir une grande étude indépendante.

Délivrance des résultats

• Patient négatif : le biologiste médical communique le résultat au patient dépisté et au médecin prescripteur ;
• Patient positif : le biologiste médical ;
• Contacte le médecin prescripteur qui communique le résultat aux patients avec les consignes (rester à domicile, surveillance des signes cliniques, numéro de contact, consultation à domicile à J7, équipement de protection du patient, règles d’hygiène à domicile...) ; si aggravation, déclenchement du circuit hospitalier (hors champ de la présente fiche) ;
• Transmet les résultats positifs à la cellule de crise des ARS selon le système de déclaration en vigueur ;
• Le prélèvement et les renseignements cliniques doivent être transmis au Centre national de référence des virus des infections respiratoires dont la grippe pour que celui-ci remplisse ses missions de surveillance.

Facturation et remboursements CNAM :

L’inscription de la détection du génome du SARS-CoV-2 par RT-PCR (code acte 5271) a été ajoutée au chapitre 19 de la nomenclature des actes de biologie médicale prévue à l’article L.162-1-7 du code de la sécurité sociale par arrêté du 6 mars 2020.

Le dépistage du SARS-CoV-2 par RT-PCR fait l’objet d’une facturation à l’acte par le LBM à l’Assurance Maladie selon le circuit classique pour les actes de biologie impliquant la transmission des données Carte Vitale et mutuelle par le patient.

B45	12,15 €	20/05/2020	RECHERCHE D'IGG ET D'IGM OU D'IG TOTAUX PAR TESTS AUTOMATISABLES DE TYPE ELISA
B45	12,15 €	20/05/2020	RECHERCHE D'IGG PAR TESTS AUTOMATISABLES DE TYPE ELISA
B35	9,45 €	20/05/2020	RECHERCHE D'IGG ET D'IGM OU D'IG TOTAUX PAR IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (TDR/TROD)
B35	9,45 €	20/05/2020	RECHERCHE D'IGG PAR TESTS SEROLOGIQUES PAR IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (TDR/TROD)

 

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