Les test de dépistage des infections par SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 : Diagnostic au Nord et en PED                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                  

 

Quelques données pour les collègues non spécialistes et  réunir en un document de synthèse les données virologiques de bases et les  tests disponibles et à venir à partir  de la littérature médicale (NEJM, Lancet, Nature, Science,  LID, CID..) et de l’expérience du service de microbiologie de l’hôpital Saint Louis de Paris 

Les données présentées et les conclusions n’engagent en rien la faculté de médecine de l’Université de Paris, ni l’AP-HP.   

Professeur François Simon ; Virologie, Université de Paris

Directeur des Laboratoires du Groupe Hospitalier Saint Louis - Lariboisière 

Directeur IMEA,  Hôpital Bichat

francois.simon@aphp.fr

 

Au  fil des années à venir et de la montée des immunités de par le monde, le SARS-CoV-2 s’ajoutera à la liste de la vingtaine de pathogènes humans respiratoires nécessitant une surveillance médicale et sa recherche fera partie des bilans systématiques hospitaliers dits syndrômiques. Dans quelques années ! D’ici là….

Les chiffres clés Avril 2020 et les perspectives de tests

Aucun chiffre délivré par la Chine – et de nombreux autre pays dont le nôtre, compte tenu des différences de politique de dépistage et de l’absence de sérologie - ne peut raisonnablement être validé. A ce jour, les chiffres ne sont pas comparables d’un pays à l’autre selon la généralisation on non des tests et des reports des décès entre hopital et Ehpad. Le nombre total de cas aux États-Unis a dépassé 370 000 cas, pour 1.3M cas mondiaux.

Mortalité globale 2 à 3%, variable d’un pays à l’autre. 20-25% au-delà de 80 ans. En réanimation en France, 50% de décès dont 80% sont en surpoids. Sinon mauvaise grippe pour les autres et nombreuses formes pauci symptomatiques (ie : anosmie isolée, toux simple avec ou sans fièvre….toute la gamme des signes pseudo grippaux). Ce sont ces formes frustres qui sont l’enjeu épidémiologique et virologique: comment diagnostiquer des réponses immunes faibles essentiellement sécrétoires et dont on ne connait ni l’intensité ni la durabilité. Ce qui est clair à ce jour :

  • Les formes sévères sont corrélées à des charges virales très élevées qui donnent naissance à des anticorps facilement identifiables y compris par nos premiers tests peu sensibles
  • Le switch isotypique est mal connu pour les Ig A mais suit les courbes classiques entre les Ig M et les Ig G. A 21 jours, tous les patients ont réalisé leur séroconversion. 
  • Au 10 avril, aucun test sérologique n’est validé et de nombreux test rapides, voire la majorité, sont totalement insuffisants pour un usage médical. L’OMS l’a signifié officiellement hier. 
  • Aucun grand fabricant (la bande des 4), seuls garants de sérieux dans leur production, ne s’oriente vers la détection d’Ig M pour l’heure. Les tests haut débit seront Ig G. 

La prévalence en France: une récente modélisation du Royal College of England parle de 3% de la population française. 

Seul les tests Elisa capables de très haut débit, automatisés,  basés sur la chemoluminescence ultra sensible sur des protéines recombinantes ou peptidiques de haute qualité, capables de détecter les Ig A, les IG M et Ig G en mode sandwich et/ou immunocapture, spécifiques, reproductibles  pourront répondre à nos besoins pour tester une large partie de la population.

Donc pas avant 5 à 6 semaines pour les premiers candidats répondant à ces critères entre Abbott, Siemens, Roche ou Beckman pour les grosses plateformes et DIasorin pour les plateformes de moyen débit. Et encore uniquement en Ig G anti S1 et/ou S2. 

Les centres de transfusions sanguine et les CHU et les privés sont capables de tester des dizaines de millions d‘échantillons par an. Il n‘ y a pas pénurie de plateforme sérologique. 

Le virus SARS-CoV-2 : son origine et sa nature 

Ce nouveau virus chez l’homme est un ß-coronavirus désigné SARS-CoV-2 (anciennement 2019-nCOV) qui partage 96,3% de l’identité génomique avec la séquence du virus BatCoV RaTG13, qui est un virus de la chauve-souris de la province de l’Hubei (à 1 150 km au sud de Pékin et 700 km à l'ouest de Shanghai. Il n’ y a – à cette heure - pas de recombinaison majeure mais juste une dérive génétique classique entre SARS CoV-2 et BatCoV RaTG13, %) à l'exception d'un segment de six acides aminés de la spicule, fragment qui pourrait avoir été transféré lors d’une recombinaison entre BatCoV RaTG13 et pangolin-CoV. 

Un peu de phylogénie 

Les comparaisons des gènes des différents coronavirus montrent bien la proximité de ces gènes entre le SARS-CoV-2 et virus BatCoV RaTG13 des chauve-souris d’une part et avec le virus du SARS. Egalement la grande proximité génétique avec le SARS CoV. 

Le SARS-CoV-2 n’est pas lui-même un recombinant majeur et garde l’organisation génomique du BatCoV RaTG13. Ce dernier par contre pourrait être le résultat de recombinaison entre d’autres coronavirus des chauves-souris. Ce qui est banal et très commun. 

 

La variabilité entre les nucléotides du génome de SARS-CoV-2 et du virus RaTG13 de la chauve-souris a été globalement estimée à 4 %. Si l’on s’intéresse aux seuls sites neutres, donc de mutations simples et sans conséquences pour le virus mais qui représentent son évolution sans pression, la valeur correspondante atteint alors 17 %. Ce qui indiquerait que le passage est plus ancien que cet automne et que la circulation chez l’homme est plus précoce que présentée par les autorités. 

Epidémiologie moléculaire du SARS-CoV-2 : pas de conséquence  à ce jour pour les tests

A ce jour aucune recombinaison, et les mutations observées sont celles naturelles de ce type de virus. On retrouve les 3 grands axes en phylo géographie consultable sur : 

https://www.gisaid.org/epiflu-applications/next-hcov-19-app/

La situation épidémiologique mondiale    voir le site 

https://gisanddata.maps.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/bda7594740fd40299423467b48e9ecf6

 

Les manifestions de la maladie dite COVID 19 

L’incubation :

La durée médiane de l’incubation est de 5,1 jours (IC 95 %, 4,5 à 5,8 jours) identique à celle du SARS de 2003 avec une durée maximale de 12 à 14 jours. La durée de la quarantaine de 14 jours adoptée en France empêche 99% des infections par SARS-CoV2. 

Pédiatrie et femmes enceintes 

Les jeunes enfants sont peu concernés: immunité non spécifique avec meilleure défense immunitaire?, manque/immaturité des récepteurs spécifiques au SARS-CoV-2 ou simplement immunité croisée avec les autres coronavirus bénins que nous avons tous attrapés justement dans l’enfance. L’infection ne semble pas se transmettre par voie verticale de la mère à l’enfant.  

Pour dix patientes, SRAS-CoV-2 tous les prélèvements vaginaux ont été testés négatifs (Liu Qiu et al https://doi.org/10.1093/cid/ciaa375

 

Par contre, cas de contamination verticale rapporté sur la base d’Ig M uniquement, la virologie  restant négative. Peu probant, les réactions faussement positives sur les tests Ig M étant fréquentes. (? )  (Lan Dong et coll. : Possible Vertical Transmission of SARS-CoV-2; March 26, 2020. doi:10.1001/jama.2020.4621)

L’allaitement peut se poursuivre  – surtout en PED. 

QQ données cliniques du COVID 19 

Pour les adultes, une dizaine de jours après le contact, le plus souvent cela se manifestera par une toux d’abord non fébrile d’allure type irritation pharyngée. Puis apparition d’une fièvre, état grippal (parfois aussi digestif avec diarrhée marquée); dans 85 % des cas, surtout chez les jeunes (<60 ans) tout rentre rapidement dans l’ordre en une semaine. A noter que sur le Diamond Princess ou tous les voyageurs ont été testés, 18% étaient totalement asymptômatiques.  

Les virus des patients pré- ou oligo-symptômatiques sont bien réplicatifs et infectieux. Sur un  suivi de 9 patients l'excrétion pharyngée était très élevée au cours de la 1ère semaine de symptômes (pic à 7 x108 copies d'ARN à J4;  SARS CoV 2 étant facilement isolé de la gorge et des poumons, mais pas des selles malgré une concentration élevée en ARN viral. Aucune virémie ni virurie. La variabilité virale observée entre échantillons de gorge et de poumon du même patient montrent une réplication indépendante entre ces sites. 
La séroconversion est survenue après 7 jours chez 50% des patients (14 jours chez tous les patients), mais n’a pas été suivie d’une baisse rapide de la charge virale – (Roman Wölfel et al Nature https://doi.org/10.1038/s41586-020-2196-x). 

Attention : il est possible de retrouver des co infections entre SARS-CoV-2, grippe saisonnière H1N1 surtout, Mycoplasme, Chlamydiae pneumoniae et bien sûr les surinfections classiques broncho pulmonaires. 

Les signes cliniques les plus fréquents du Covid-19 sont ceux d’une infection respiratoire aigüe, allant de formes pauci-symptomatiques jusqu’à une pneumonie, sans ou avec signes de gravité (syndrome de détresse respiratoire aigüe, voire défaillance multi-viscérale). Toutefois des formes avec symptomatologie digestive, état confusionnel, initialement non fébriles sont souvent au premier plan chez les personnes âgées. En présence d’une anosmie sans obstruction nasale et avec une agueusie, le diagnostic de Covid-19 est à considérer comme vraisemblable et ces patients doivent être de facto isolés; ne pas les traiter par corticoïdes inhalés ou per os et les lavages de nez sont contre-indiqués. Acrosyndromes douloureux  

Les complications lors  de COVID 19 

Dans une analyse de 45 000 COVID-19 en Chine, la mortalité était de 0,9 % pour les patients sans comorbidité documentée. Elle serait de moitié en Allemagne; comme aucun chiffre n’est fiable quant à la prévalence…

Les facteurs prédictifs de mortalité sur 150 cas de Wuhan : taux élevé de ferritine (moyenne de 1297,6 ng/mL chez les patients décédés versus 614,0 ng/mL chez les survivants ; p < 0,001) et d'IL-6 (p < 0,0001). La mortalité pourrait être due à l’hyper-inflammation d'origine virale. Comme lors des pandémies précédentes (SARS et MERS-Cov), les corticostéroïdes ne sont pas recommandés en routine et pourraient aggraver les lésions pulmonaires.

20 % de patients souffrent d’un dommage microvasculaire de par la présence des récepteurs au niveau du myocarde, et des myocardites  peuvent survenir en dehors de l’atteinte pulmonaire. La pro-thrombogènèse est également altérée avec des syndromes coronaires conduisant à anticoaguler avec alors des  D-dimères très élevés. (JP Collet, P-S) 

Un sous-groupe de patients  peuvent présenter un orage cytokinique, c’est-à-dire une réaction immunitaire potentiellement fatale consistant en une rétroaction entre cytokines et leucocytes. Une lymphohistiocytose hémophagocytaire secondaire avec hypercytokinémie et défaillance multiviscérale : fièvre constante, cytopénie et hyperferritinémie. 

Intérêt du tocilizumab et des antagonistes  du récepteur  IL-6? 

 

L’importance de la charge virale 

La charge virale SARS-CoV-2 est plus élevée et maintenue de façon plus prolongée chez les patients présentant une forme grave de COVID-19 que chez ceux ayant une forme légère. (Liu Y,  Viral dynamics in mild and severe cases of COVID-19. Lancet Infect Dis. 2020 Mar 19 [Epub ahead of print]. doi: 10.1016). La  RT-PCR à partir des prélèvements nasopharyngés chez 46 cas légers vs 30 cas en détresse respiratoire a montré que la charge virale dans les formes graves de la maladie était[1]  environ 60 fois plus élevée que dans les formes légères. 90% des patients présentant des formes légères présentaient une clairance virale à J10. 

 

Une autre étude à Hong Kong (Kai-Wang To,LID (20)30196-1)  montre que la charge virale (valeur médiane) dans la salive de l’oropharynx postérieur et les autres prélèvements respiratoires est de 5,2 log10 copies par ml (4,1–7,0) au début des signes baisse avec le temps, l’ARN viral pouvant être détectable jusqu’à 25 jours. L’âge et la gravité de l’infection sont corrélés à la charge virale . A la différence  du SARS-CoV-1  et  MERS-CoV, le SARS-CoV-2  présente une charge virale maximale au moment où la maladie commence à s’exprimer cliniquement (alors que, dans le cas des deux autres viroses, la charge virale est maximale entre le 7ème et le 10ème jour). Mais des biais de recrutement clinique sont possibles, les outils et l’organisation actuels permettant une mise en évidence plus précoce des cas. 

Caractéristiques de l'excrétion virale dans les échantillons (données  agrégés : B, ARN viral dans les voies respiratoires supérieures; C,ARN viral expectorations et de selles.D, séroconversion & isolement /symptoms;  E, isolement du virus et charge virale. F et G, isolement du virus  courbes probit (règle dose-réponse). H, transcrits d'ARN viral subgénomique en relation avec  ARN  viral. Les points représentent les valeurs moyennes des données RT-PCR obtenues à partir de au moins deux expériences indépendantes   

Pour un taux  d'isolement du SARS-CoV-2  inférieur à 5%, il faut  9,78 jours  (IC à 95%: 8,45-21,78) et  6,51 Log10 ARN / ml (IC à 95%: -4,11-5,40)  Roman Wölfel, Nature https://doi.org/10.1038/s41586-020-)

 

Le diagnostic en PED 

Au delà du scanner souvent impossible, on verra sur les poumons des opacités périphériques et une image en verre dépoli. Des examens très utilisés par les collègues Chinois se font à partir d’une prise de sang: la  baisse – parfois marquée - des lymphocytes (et aussi des plaquettes) et une augmentation –  marquée -  de la CRP. Associés à la toux et au contexte, cette combinaison a une forte valeur prédictive positive et suffit dans le cadre des fortes prévalences. Des automates simples et unitaires de PCR sont désormais disponibles comme Genexpert, Quiastat ou Abbott et probablement bien d’autres. Voir ci-dessous. Les sérologies sur tests rapides au 10 avril ne sont pas recommandées au vu de la faible qualité des tests et du manque d’évaluation. La charge virale est de peu d’aide. Des tests rapides pour la CRP, la VS ainsi que de petits automates de numérations complètent le laboratoire de base. Un automate de type Picolo pour les constances de bases est nécessaire. 

 

La réponse anticorps 

 

Mary E. Wilson a fait dans le dernier NEJM une synthèse des travaux sur la sérologie au 03 Avril en analysant les publications de Guo L et al. Clin Infect Dis 2020 21 mars, de  Zhao J et al. Clin Infect Dis 2020 28 mars et de Li Z et al. J Med Virol 2020 27 février. J’y rajoute mes propres commentaires (FS) car beaucoup de questions encore.

1. Guo et al ont étudié la cinétique de  réponse des  IgM , IgA et IgG par un  ELISA basé sur la  nucléocapside SRAS-CoV-2 sur 208 plasmas provenant de 82 cas confirmés et 58 cas probables de COVID-19.Les anticorps sont retrouvés dès le premier jour suivant l'apparition des symptômes. 

FS : ce qui ne manque pas d’être surprenant dans notre perception des primo infection en virologie et vaccinologie, les anticorps apparaissant en général la semaine suivant les symptômes. On pourrait penser que les inclusions dans l’étude ne sont pas carrées ou que la physiopathologie du Covid 19 doit être mieux comprise au stade précoce.

Les  IgM sont plus souvent détectées que l’ARN dès 5,5  jours de maladie. La combinaison de l'ELISA IgM et de PCR  détecte 98,6 % des cas contre 51,9 % avec une seule PCR. 

FS : encore une fois on est surpris par ces résultats de précocité de réponse des IgM sachant que l’on attend avant une réponse Ig A secrétoire. La sensibilité / prélèvements des PCR de l’équipe est peut être insuffisante ? 

Aucune réactivité croisée n'a été trouvée avec les coronavirus courants. En groupe familial, les contacts négatifs en PCR avaient un test sérologique positif, confirmant la présence d'anticorps dans l'infection asymptômatique. 

FS: L’absence de titrage ne permet pas de mieux connaitre la réponse chez les asymptômatiques, élément essentiel pour le déconfinement. 

2.Li et al : un test par immunchromatographie IgM et IgG du sang capillaire a été testé dans six provinces sur 397 patients dont la COVID-19 par PCR et sur 128 négatifs: la sensibilité globale était de 88,7 % et la spécificité de 90,6 %. A noter que plusieurs auteurs étaient affiliés à la société Jiangsu Medomics Medical Technology Co., Ltd., Nanjing qui commercialise ce test. 

FS : ces résultats sont très inquiétants car la sensibilité et la spécificité ne sont pas  suffisantes. Et les lectures de ces tests sont liées à la subjectivité, comme le montrent nos premières lectures sur ce type de test

3.Zhao et al ont recherché les anticorps totaux, les IgM et les IgG chez 173 patients (âge médian, 48 ans) atteints de COVID-19 confirmés par PCR à Shenzhen par kits ELISA Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co, Ltd, Beijing, Chine.

 

Au cours des 7 premiers jours suivant le début de la maladie, les taux de positivité étaient de 66,7 % pour la PCR et de 38,3 % pour les d'anticorps. Au cours de la deuxième semaine, les taux étaient de 54,0 % et de 89,6 % pour les tests d'anticorps. L'utilisation combinée de la PCR et d'anticorps améliore la positivité à travers les différentes phases de la maladie. L'augmentation des taux d'anticorps n'a pas été associée à la clairance de l'ARN, y compris chez trois patients atteints de forme grave. Une forte corrélation est constatée entre la gravité clinique et le titre d'anticorps plus de deux semaines après le début de la maladie.  

 

La présence d'anticorps est < à 40 % la semaine suivant l'apparition des signes pour atteindre 100 % (Ab), 94,3 % (IgM) et 79,8 % (IgG) au  15e jour. La  détectabilité de l'ARN passe de 66,7 % (58/87) dans les échantillons prélevés avant le 7e jour à 45,5 % (25/55) après le 15e, 16e et 19e jours. La combinaison ARN + anticorps améliore la sensibilité du diagnostic même dans la phase précoce d'une semaine. De plus, un titre d'Ac plus élevé est indépendamment associé à la gravité clinique

 

 

  1. Dans l’étude de Hong Kong (Kai-Wang To, LID (20)30196-1)  combinant cinétique de charge virale et sérologie, au 14eme jour après le début des signes, les taux de + Ac sont anti-NP IgG (n=15) : 94 % ; (2) anti-NP IgM (n=14) : 88 % ; (3) anti-RBD IgG (n=16) : 100 % ; (4) anti-RBD IgM (n=15) : 94 %. Les taux d’anticorps IgG anti-SARS-CoV-2-NP ou anti-SARS-CoV-2-RBD sont corrélés aux titres des anticorps neutralisants  (R² >0,9). 

 

 

Le diagnostic virologique de l’infection

Les prélèvements : indications et modalités

QUOI PRELEVER    

Le virus SARS-CoV-2 ne se retrouve pas dans le sang sauf pour les cas graves, ni dans les urines et certainement pas dans les sécrétions génitales. Il est également présent dans les selles.

Le LBA (Lavage broncho-alvéolaire) est le plus sensible mais n’est pas pratiqué. Seul le prélèvement naso-pharyngé est utilisé en pratique. Sa sensibilité est excellente même si elle a été critiquée. En cas de doute ou d’impossibilité de pratiquer le prélèvement naso pharyngé, penser à la présence possible fréquente dans les selles. 

Les  test rapides de détection antigénique  ne sont pas validés (que l’on pourrait faire sur place avec le patient), qui détecterait directement le virus. Ce type de tests existe pour la grippe et ils peuvent aussi être d’intérêt pour écarter le COVID 19 en cas de  détresse respiratoire. Leur amélioration est attendue mais pour l’heure à éviter avant évaluations soigneuses du taux de faux négatifs. 

L’étude du JAMA du 11 Mars :

1 070 échantillons de 205 patients par PCR :

Les prélèvements pharyngés ont été effectués entre le 1er et le 3ème jour après l’admission. D’autres prélèvements ont porté sur le sang, l’expectoration, les fécès et les urines tout au long de l’évolution de la maladie. Une fibroscopie avec lavage broncho-alvéolaire (+/-biopsie) n’a concerné que les patients atteints d’une pneumonie sévère ou encore ceux mis sous ventilation assistée (soit 19 % de la cohorte). 

En cas de présence de virus dans les selles, quatre échantillons de ces dernières ont été mis en culture en vue d’une étude par microscopie électronique.  

La positivité maximale dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (14/15 ; 93 %) rarement effectué (environ 7 % des cas), puis (1) l’expectoration (72/104 ; 72 %);  (2) les écouvillonnages nasaux (5/8 ; 63 %); (3) la biopsie bronchique (6/13 ; 46 %); (4) les prélèvements pharyngés (126/398 ; 32 %); (5) les fécès (44/153 ; 29 %) ;(6) le sang (3/307 ; 1%).

Aucun échantillon urinaire ne s’est avéré positif.

Plusieurs cas de « faux négatifs » rapportés conduisent à la multiplication des scanners voire à leur utilisation comme diagnostic COVID 19.

Avec l’évolution de la maladie, les mécanismes inflammatoires et non virologiques pourraient expliquer des tests négatifs chez des patients. Ce qui est un peu en discordance avec le portage long rapporté en général.  Au début de l’infection bien avant de passer en réa, les faux-négatifs sont dus à la qualité du prélèvement qui doit être refait si le clinicien et le radiologue sont perplexes.

 

QUI PRELEVER Les indications au  10   04 2020  

 

Les indications de RT-PCR pour recherche du virus SARS-CoV-2 ne concernent, en principe, que des personnes symptomatiques. Au 07 avril, seuls font encore l’objet de tests systématiques pour recherche du virus SARS-CoV-2 : 

· Les patients hospitalisés pour un tableau clinique évocateur de COVID-19 afin de valider le diagnostic et éviter la transmission par des mesures d’isolement et d’hygiène appropriées ; 

· Le suivi de l’excrétion virale chez les patients graves en réanimation afin de guider le traitement ; 

· Tous les professionnels de santé ou personnels des structures médico-sociales et d’hébergement dès l’apparition des symptômes évocateurs de COVID-19 ; 

· Les personnes à risque de formes graves et présentant des symptômes évocateurs de COVID- 19 ; 

· Les femmes enceintes symptomatiques quel que soit le terme de la grossesse ; 

· Les donneurs d’organes, tissus ou cellules souches hématopoïétiques. 

 

Les trois premiers patients dans le cadre de l’exploration d’un foyer de cas possibles au sein d’une structure d’hébergement collectif (en particulier collectivités de personnes âgées mais aussi lieux d’accueil pour les personnes avec un handicap, milieu carcéral, casernes, résidences universitaires…). 

De plus, les personnels symptomatiques des opérateurs d’importance vitale sont également prioritaires pour la réalisation des tests de diagnostic. 

Pour les autres patients symptomatiques, l’examen clinique devient majeur dans l’identification et la bonne orientation des patients Covid-19. 

Dans le cas où un prélèvement en vue de confirmer le diagnostic serait indiqué, il faut indiquer sur l’ordonnance, en plus du test à réaliser, les facteurs de risque et les signes cliniques associés du patient. 

Il conviendra d’indiquer au patient la procédure à suivre pour la réalisation du prélèvement (prescription, prise de contact avec le LBM qui indiquera le lieu de réalisation du prélèvement). 

Les résultats devront être communiqués au patient dans un délai de 48 heures maximum. 

Dans l’attente des résultats du test, le patient devra rester chez lui en respectant les consignes préconisées : https://solidarites-sante.gouv.fr/IMG/pdf/covid-19_fiche_medecin_v16032 020falise.pdf

 

 

COMMENT PRELEVER : Modalités   la détection SARS-CoV2 (COVID19)  

La PCR se pratiquera après extraction des acides nucléiques par le laboratoire sur  écouvillon naso-pharyngé (Cf méthode de prélèvement pour la recherche de grippe/VRS sur VISKALI : 1 tube COPAN ou 2 tubes VIROCULT)

Voir les tuto :

https://www.youtube.com/watch?v=obN9nzewd90

https://www.youtube.com/watch?v=DVJNWefmHjE

 

Ou Lavage broncho-alvéolaire

Ou Aspiration trachéale ou bronchique

Ou lavage de gorge ( ? A valider) 

 

le lavage de gorge avec 10 ml de solution  saline est proposé  par  Makoto Saitoet al in CID https://doi.org/10.1093/cid/ciaa377. Voir aussi Bennett S et al. J Virol Methods,2017;248:83-6.

Attention à la qualité de ce prélèvement, fondamentale pour pouvoir interpréter les résultats 

Des techniques alternatives d’auto prélèvement avec écouvillon en bucco-pharyngé se développent en Chine avec des résultats assez satisfaisants  en sensibilité. Peut être  utiles pour le suivi PCR des patients. mieux tolérées et exposent moins le soignant au risque de contamination. A promouvoir quand le diagnostic est établi

Le test: il existe des CENTAINES de tests pour le SARS CoV -2 ! Voir en annexe un échantillon. Rares sont ceux qui sont validés selon les procédures CE IVD. 

En général les laboratoires de virologie vont utiliser plusieurs kits pour dépister et confirmer l’infection.

 

TESTS DE RECHERCHE DE L’ARN VIRAL

Idée fausse : il existerait de nombreux faux négatifes en PCR : 

Gilbert Greub à l’Institut de microbiologie du CHU Vaudois Lausanne  a réalisé plus de 14 000 tests PCR depuis le début de la pandémie. Sur ce total, seulement une quinzaine ont eu des résultats discordants alors qu’ils étaient prélevés à un ou deux jours d’intervalle.    La qualité des prélèvements et le sérieux des laboratoires montrent que la PCR reste l’outil de base.

https://www.chuv.ch/fr/microbiologie

 

LES TECHNIQUES CLASSIQUES AUTOMATISEES

Le Cobas Roche: ce test est un test RT-PCR en temps réel qui permet la détection qualitative du virus dans des échantillons d'écouvillons nasopharyngés et oropharyngés ; résultats en trois heures et demie. Attention seuls les laboratoires équipés des automates 6800 (les hôpitaux) ou 8800 (CTS et labos privés types Cerba) peuvent réaliser le test. Traite jusqu'à 384 (cobas® 6800) et 960 tests (cobas® 8800) dans un délai de 8 heures. En pratique optimale ( !) jusqu'à 96 résultats en moins de 3,5 heures*, puis 96 résultats supplémentaires toutes les 90 minutes pour cobas® 6800 (et toutes les 30 minutes pour 8800). Les automates sont construits en Suisse mais le test produit aux USA.   

L’automate Qiastat peut rendre un résultat en 1h unitaire et détecte 11 autres pathogènes respiratoires. 

Le test Genmark E-Plex unitaire automatisé disponible au compte-gouttes la semaine à venir 100 € le point

Cepheid, la référence, nécessite un automate spécifique qui peut réaliser de 3 à 6,12, 24  ou plus selon le nombre de modules. Proposé à 20 U$ le point pour le fond mondial. Qualitatif  l’APHP est livré mais compte-gouttes.

Les kits commerciaux Chinois ou les techniques maison permettent de rendre un résultat en 3-4h.  Des centaines sont proposés.  A éviter +++ si pas de validation nationale. 

Le test commercialisé adaptable sur chaine ouverte comme Altona largement utilisé  donne de bons  résultats.   

LES TECHNIQUES DITES MAISON (PCR test ‘’Allemand’’ de Drosten ou Pasteur ou autres)  doivent être manipulés avec soin uniquement par des laboratoires expérimentés en raison des risques de contaminations des tests donnant de faux positifs.  

Les laboratoires moins équipés, moins expérimentés et avec un moindre débit pourront s’orienter vers les automates types Qiastat ; E pLex, bioFIre (a venir) Cepheid.., unitaires mais corrects et abordables. Et qui donnent les co-infections simultanément. 

 Cher (>100 euros le test + achat de l’automate (avec 3, 6 12 tests par analyse)

Si les laboratoires sont déjà équipés en Cepheid GenXpert, le test est disponible  réalisable en 45 mn.

D’autres automates font leur apparition sans cesse. Mais il faut rester sur du connu. Surcout pour l’Afrique pour assurer la distribution. 

A cette heure, les tests syndromiques (ie BioFire) sauf Qiastat ne sont pas encore modifiés pour reconnaitre le SARS CoV-2 et le seront dans les mois à venir.

 

LES TESTS RAPIDES MOLECULAIRES POUR L’ARN :
 

Ils  détectent de façon unitaire l’ARN des écouvillons. Un grand avenir car ils seront sensibles dans le même ordre que les tests actuels et permettront un diagnostic dès les urgences. Un petit automate est nécessaire 

1/ ID NOW COVID-19 Test:  50 000 de ces tests allaient être livrés cette semaine outre-Atlantique. Détectera l’ARN en 5 mn en cas de positivité et 13 mn pour un résultats négatif. La technique est la plus rapide basée sur un système isothermal . Abbott vise 50 000 tests par jour en production.

Pour les Drive ?    

 

 

 

2/ Biosynex France commercialisera un  test développé par la société singapourienne Credo Diagnostics Biomedical basé sur le même principe. 

 

 

3/ Bfiocure : idem cette fois le résultat promis en....10 mn 

Avec leur système Chronos. A valider

 

 

 

4/ En recherche Française : le  test EasyCov à partir d’un écouvillon et de réactif mis à 65° pendant 30 mn    lisible à l'œil nu a déjà permis de détecter de l'ARN viral isolé en laboratoire et du virus actif donc à très haute concentration. Sys2Diag, du CNRS et CHU de Montpellier vont évaluer sa performance en double aveugle sur 180 échantillons salivaires.  Résultats fin Avril.

 

 

 

 

La liste FIND des test donne  le tournis avec ses 242 tests ARN  proposés

https://www.finddx.org/covid-19/pipeline/

 

La quantification de la charge virale  : attention, on l’exprime en CT (Cycle Threshold) ce qui doit être bien compris alors que les PCR se basent sur des dilutions donc sur un calcul en  logarithme. CT correspond au point seuil pour lequel le signal est supérieur au bruit de fond, c'est-à-dire au nombre de cycles minimal pour lequel l'ADN amplifié est détectable. Ce point est atteint en début de phase exponentielle. Plus la quantité d'ADN initiale sera faible, plus le CT sera élevé. Plus le CT est bas (ie 16,18 cycles ) plus la quantité d’ADN (donc après rétro-transcription dans le cas des virus ARN) dans l’échantillon est importante. Inversement plus le CT est élevé moins il y a d’ADN et surtout moins la PCR est répétable. Au-delà de 35 CT, il faut oublier la valeur ‘quantitative ‘ de la PCR et interpréter avec prudence le résultat. 

Les cliniciens sont habitués à faire confiance à leur virologue pour interpréter les résultats et se reposent sur l’idée de qualité des tests HIV HVC etc.. Mais un prélèvement sanguin hautement standardisé et répétable ne peut être comparé à un écouvillonnage. 

 

La liste des tests validés en France : pour l’heure seuls les tests moléculaires sont enregistrés

https://www.ameli.fr/laboratoire-danalyses-medicales/actualites/diagnostic-de-sars-cov-2-la-liste-des-tests-valides

 

 

 

 

TESTS DE RECHERCHE DES ANTICORPS :

 

Avertissement:   Ces réactifs de diagnostic sont des dispositifs médicaux de diagnostic in vitro et les tests validés par l’ANSM pour le diagnostic de SARS-CoV-2.

Ils relèvent sur le plan réglementaire de la directive européenne 98/79/CE, c’est-à-dire qu’ils peuvent être mis sur le marché européen sous l’entière responsabilité de leurs fabricants après avoir été marqués CE conformément aux exigences de cette directive.

Les dispositifs utilisés aujourd’hui pour le diagnostic du SARS-CoV-2 sont des réactifs de détection du génome du virus par RT-PCR. (HAS) relatif à l’inscription sur la liste des actes et prestations mentionnée à l’article L. 162-1-7 du Code de la sécurité sociale.

 

  AUCUNE EVALUATION DONNEE PAR LE FABRICANT NE PEUT ETRE VALIDEE SANS CONTROLE EXTERNE

 

Attention : un dépistage généralisé ne peut s’entendre qu’avec des outils adaptés à savoir des tests Elisa réalisés sur des automates à haut débit capables de gérer plusieurs milliers de tubes par jour. A ce jour, seuls au monde, Abbott, Siemens, Roche, et Beckman peuvent répondre à ces enjeux de qualité sensibilité, spécificité et haut débit. Il ne faut rien espérer avant 1 à 2 mois. Les tests actuellement disponibles ne sont pas validés; peu de tests Elisa tous chinois non validés et les tests rapides très peu sensibles et in fine couteux . Seul DiaSOrin arrive avec une expérience de respectabilité dans le milieu; mais production et débit faibles. 

D’autre part, la réponse immune attendue risque d’être faible chez les patients a - ou pauci symptomatiques. Elle pourrait aussi d’être de courte durée. Sans compter que ce sont des Ig A sécrétoires le plus souvent et que le switch vers les Ig G n’est pas bien décrit par les collègues chinois. Donc au 10 04,  des outils peu adaptés en terme de qualité et de débit qui risquent de jeter un peu plus de confusion …Soyez prudent et pas d’espoir trop rapide. 

 

Il s’agira essentiellement d’une réponse locale pulmonaire de type sécrétoire Ig A de durée plus réduite. La présence d’Ig M et Ig G est aussi possible après le switch isotypique. Toutes les études bien conduites montrent que l’on est dans une infection classique quant à la dynamique d’apparition des anticorps: Ig A & Ig M puis Ig G vers 10-15 jours au plus tard 21 jours. La seule question est le taux d’anticorps et leur détectabilité chez les a - ou pauci symptomatiques et surtout le manque de sensibilité des tests (surtout les tests rapides) pour détecter ces populations. Leur durée dans le temps  et l’expérience montrent la permanence des IG G sur des années y compris pour les virus respiratoires pour autant que les tests soient sensibles. Et les patients SARS-COV de 2003 ont encore des IgG. 

 

Les grands tests sur automate :

 

Une lueur:   le test Diasorin fabriqué et évalué en Italie pourrait permettre du débit semi rapide. Il détecte les anticorps Ig G anti S1 et S2. Il dispose du marquage CE, et disponibilité du kit fin avril en France mais en disponibilité limitée jusqu'à fin juillet. Des plateformes automatisées Liaison XL (170 serum /heure) permettent denvisager des  séries de plusieurs centaines d’échantillons par jour. Les évaluations ont été faites en Lombardie et Diasorin est reconnu pour son sérieux dans la production des kits de diagnostic.

Cest le premier test ELISA de fabrication européenne qui peut inspirer confiance mais sa production va être très limitée et la demande très forte; Il serait idéal pour les études ponctuelles : épidémiologie, personnel Ehpad et soignants.

 

- Abbott : les réactifs seront disponibles pour les automates Architect et Alinity. En premier les Ig G. Peut être des IG M ou un combo  M + G ? 200 tests /heure plus tard. 

- Pour Siemens, en attente pour les plateformes Atellica® Solution et ADVIA Centaur® XP/XPT/CP – Idem Roche 

- Beckman, en attente pour l’automate haut débit; tests fabriqués en France ce qui évitera un embargo US l’automate UniCel DxI 800 Access permet  400 tests /heure. 

 

Les tests EIA en plaques semi manuels

 

Test EIA 96 puits distribué en France: SARS-CoV-2 virus lysat purifiés comme antigène ELISA kits indirect pour les Ig G et par immunocapture pour les igM: GENOMIC VISION Green Square Bâtiment E 80-84 rue des Meuniers 92220 Bagneux - France Tél. (33) 1 49 08 54 41Tél (33) 6 81 87 37 91www.genomicvision.com.

 

- Test EIA 96 Orgentec 

- Test EIA 96 EuroImmun Ig A et I g G 

-  etc …../ Rien  de validé pour l’heure

 

LES TESTS RAPIDES : UNITAIRES  LES MOINS SENSIBLES A EVITER SAUF VALIDATION EN FRANCE.

Le 08 avril , WHO recommends the use of these new point-of-care immunodiagnostic tests only in research settings

Premiers essais dès le début de la crise de tests dits immuno-chromatographiques en Chine pour détecter au lit du malade les anticorps IgM et IgG anti SARS-CoV-2. 

Exemple : 397 PCR confirmed COVID-19 sérum: 128 négatifs: sensibilité 88.66%; spécificité   90.63%. Pas terrible

 

 

.

 

* 1er test FDA Approved: CELLEX qSARS-CoV-2 IgG/IgM Rapid Test Positive Percent Agreement of 93.75% (95% CI: 88.06-97.26%) and Negative Percent Agreement 96.40% (95% CI: 92.26-97.78%),

 

 

Note de FS : inutile de souligner que dans la réalité les bandes n’ont rien à voir avec celles présentées par le fabricant

 

 

Les tests rapides Anticorps disponibles en France ou dans les jours à venir  

Aucun n’est validé . Une action est en cours via la collégiale de virologie vers les conseils des ordres  pour encadrer les pratiques (les dérives actuelles) dans les laboratoires privés

 

Mobidiag (HQ)

Le test rapide Anti-SARS-CoV-2   détecte  les IgG et IgM dans le sérum, le sang   ou le plasma en 15 minutes environ. Fabriqué par Autobio Diagnostics partenaire de Mobidiag   172 rue de Charonne 75011 Paris adv@mobidiag.com

 

Hardy diagnostic 

 A priori double piste G et M  pour  sérum, le sang ou le plasma en 15 minutes environ. La  double piste est un plus. 
•   sensibilité  spécificité  >  96.2% ( ?? selon le fabricant) 

PHarmact idem propose les seuils de sensibilité suivants : 

Stade précoce 4-10 j : IgM 70%

Stade  tardif  Ig M 11-24 : 92.3% et Ig G 98.6%

  

COVID-PRESTO® IgG/IgM est marqué CE par AAZ  - Nephrotek

En 10 minutes, à partir de 10 μl de sang au bout du doigt, le test montre une positivité entre J8 et J21 après l'apparition des premiers symptômes pour l'ensemble des patients testés (résultats préliminaires de deux études d'évaluation actuellement en cours en France). AAZ 43 rue de Bellevue ; 92100 Boulogne-Billancourt; www.covid19aaz.com

 

NG-Test IgG-IgM COVID-19 de la société bretonne NG Biotech avec les honneurs de la presse: en 15 minutes pour détecter et différencier Ig G et M. Premiers essais encourageants mais à transformer en production industrielle. Avec son ‘auto piqueur ‘ pour collecte du sang capillaire…Chic

 

BioSpeedia, se présente comme une émanation de l'Institut Pasteur et propose une technique rapide par immunochromographie. Une première étude à St Etienne (Pr B Pozzeto) menée sur 146  sérums montrerait une spécificité de 98 à 100% et une sensibilité de 95,5 à 100%. 

 

Au Royaume Uni, 3,5 millions d'autotests du coronavirus, 15 minutes, devaient être distribués aux citoyens… mais les autorités se rendent compte que les tests rapides ne sont pas évalués correctement et reviennent sur leur décision. Idem l’Espagne a retourné ses commandes au fabricant. 

Les tests de détection des antigènes sur les écouvillons naso pharyngés ou par auto prélèvements de gorge

 

Attention qualité très peu fiable non recommandés par l’oMS : WHO does not currently recommend the use of antigen-detecting rapid diagnostic tests (08 04) 

Une mine d’or surement exploitée par les fabricants – (parfois peu scrupuleux sur la qualité)! Il s’agit de remplacer la PCR par un ‘docteur test’ comme ceux-ci-dessus pour détecter les anticorps mais cette fois pour détecter les antigènes viraux;  mais  détecter les antigènes c’est compliqué et peu sensible. En Afrique ou dans les situations compliquées; la sensibilité attendue est de 60%.   

 

Et bien d’autres des centaines à venir y compris les produits frauduleux  ….voir annexe  FIND propose 233 tests sérologiques

https://www.finddx.org/covid-19/pipeline/?section=immunoassays#diag_tab

 

 

 

 

ANNEXE

COMMENT FAIRE LE PRELEVEMENT :

Revoir les tutoriels dans le texte ci dessus

 

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REALISER LE PRELEVEMENT 

Les précautions d’hygiène recommandées pour la prise en charge d’un patient reposent sur le strict respect des précautions standards complétées par des précautions complémentaires de type « air » et « contact ». 

1 Mode de Transmission 

· Transmission interhumaine à SARS-CoV-2 se fait par : 

" La projection de gouttelettes ; 

" Un contact direct ; 

" L’intermédiaire de surfaces souillées ; 

" Aérosol possible lors de soins exposants. 

· Le virus persiste jusqu’à 3 heures sur des surfaces inertes sèches et jusqu’à 6 jours en milieu aqueux· Sensibilités aux désinfectants usuels virucides: hypochlorite de sodium à 0.5%, acide peracétique/péroxyde d’hydrogène, éthanol ou isopropanol à 70%, glutaraldéhyde norme EN 14476. A utiliser suivant les recommandations du fabricant (concentration et temps de contact). 

2 Prélèvement à réaliser chez un patient possible ou confirmé Covid-19 

Le prélèvement que vous allez réaliser s’inscrit dans le cadre d’une prescription médicale. 

2.1 Prélèvement à domicile 

· Demander au patient de revêtir un masque chirurgical et l’informer de la nécessité des mesures de protection devant être prises (fiche patient). 

· Tenue recommandée pour le préleveur 

" Port d’un masque de protection type (APR) FFP2 en vérifiant l’étanchéité au visage (réalisation d’un fit check) pour tout personnel de santé habilité aux prélèvements avant d’entrer dans la chambre ; 

" Sur-blouse à usage unique à manches longues ; 

" Port systématique de lunettes de protection ; 

" Port d’une protection complète de la chevelure (charlotte, calot couvrant…) ; 

" Port de gants à usage unique. 

 

· Réalisation du prélèvement 

" Le prélèvement est réalisé par des personnels formés et équipés ; 

" Prélèvement de type naso-pharyngé des voies respiratoires hautes par écouvillon de type Virocult, UTM ou Eswab (voir ci-dessus en  mode déradé si écouvillon sec )

" La traçabilité du prélèvement doit être effectuée sur place (identification du patient et du prélèvement). 

· Maitrise de l’élimination des déchets 

" En cas de prélèvement réalisé au domicile du patient, les équipements de protection individuelle (EPI) doivent être retirés avant la sortie du domicile et éliminés en double emballage fermé, sauf pour les lunettes qui seront retirées après la sortie du domicile ; 

" Les lunettes devront être nettoyées au moyen de lingettes désinfectantes virucides ou à l’eau de Javel 0,5% ; 

" Réalisation avec une rigueur absolue des gestes d’hygiène des mains par friction hydro-alcoolique ou lavage des mains. 

 

2.2 Prélèvement dans le cadre d’un circuit ambulatoire dédié et isolé 

Exemples : circuit isolé dans un centre de santé ou une MSP, centre de prélèvements dédié, circuit dédié au sein d’un LBM y compris par organisation d’un « drive », LBM dédié 

· Patient 

" En cas d’organisation en « drive », le prélèvement naso-pharyngé peut être réalisé directement dans le véhicule du patient, fenêtre baissée, sur un site réservé où il peut stationner ; 

" Le patient se présentant à pied devra être muni d’un masque chirurgical à son arrivée. S’il n’en dispose pas à son arrivée, un masque devra lui être remis dès son accès dans l’espace dédié. Il ne devra l’enlever que pour qu’il soit procédé au prélèvement naso-pharyngé.

· Tenue recommandée 

" Protection du prélever habilité (charlotte, masque FFP2, lunette et blouse et survolées si non imperméable ou un tablier dessous). 

· Installation technique 

" Le circuit dédié devra comporter un système permettant une identification fiable du patient par un étiquetage du tube prélevé, par connexion directe au système d’information du LBM lorsque cela est possible. 

 

3 Conduite à tenir, en cas d’exposition accidentelle 

En cas d’exposition accidentelle, vous devez respecter les recommandations aux professionnels de santé en contact avec des patients confirmés. 

 

 

 

3 Conditionnement et conservation du prélèvement avant acheminement 

Le prélèvement doit être conditionné dans un triple emballage souple s’il n’est pas acheminé directement au laboratoire de biologie médicale il doit être conservé à +4°C.   

Transport des échantillons

  • Il faut suivre les recommandations de l’EOH de protection individuelle pour la réalisation du prélèvement (incluant la double paire de gants, masque FFP2, charlotte, sur-blouse blanche, lunettes)
  • Après réalisation du prélèvement respiratoire, le tube contenant l’écouvillon sera déposé dans un plateau 
  • Retirer la première paire de gants 
  • Désinfecter le prélèvement en le vaporisant de surfa’ safe Premium®➔ temps de contact à respecter = 5 min. 
  • Ensuite, le tube sera ensuite placé dans un autre sachet sans contaminer l’extérieur du sachet. 
  • Fermer le sachet
  • Mettre ce premier sachet dans un second sachet avec la prescription  « SARS CoV2 »  

 

Ne pas utiliser de système pneumatique; en cas de transport à l’extérieur de l’établissement se conformer aux réglementations en vigueur 

 

ATTENTION :  écouvillons secs en mode dégradé  

Les écouvillons pour prélèvements naso-pharyngés étant en rupture de stock,  procédure dégradée de prélèvement nasal (et non plus naso-pharyngé).

 

 

 

 

 

 

Attention à l’asepsie et à bien nettoyer les tubes de prélèvements.

 

sur cette page, je ne visualise aucune des deux figures supposées être dans les deux cadres………